虾青素对缺血-再灌注致血管性认知功能障碍小鼠的神经保护作用及其机制的探讨

摘要

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是一种由脑血管疾病引起的脑部血流量(cerebral blood flow,CBF)降低或阻断致严重认知功能受损的神经系统退行性疾病。随着经济发展和人民生活水平的提高，脑血管病的发病率逐年升高，并有年轻化的趋势。VD逐渐成为继阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)之后的第二大痴呆类型，给患者及家庭带来了沉重的经济负担和心理压力。患者在诊断为VD时，往往错过了早期预防治疗的最佳时期，因此在 VD的研究基础上提出了更广泛的概念-血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment,VCI)。VCI指由于各种脑血管疾病引起的从轻度认知功能障碍到痴呆的一类综合征。研究发现，脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)导致进展性的学习记忆障碍及海马部位神经元损伤是引起 VCI的重要原因之一。因此，研究缺血再灌注引起 VCI的发病机制及相关治疗越来越受到关注。
　　目前脑IR引发VCI的确切发病机制尚不十分明确，但已有研究发现脑IR引起的氧化应激损伤海马神经元可能是VCI的重要发病机制之一。脑组织尤其是海马对缺血缺氧非常敏感。脑IR会导致神经元正常代谢紊乱，细胞内活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)生成增加，超出了其清除能力，体内氧化系统和抗氧化系统的动态平衡被打破，诱发氧化应激引起神经元损伤。其中，丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是膜脂质过氧化的一个重要指标,反映了氧化应激损伤的严重程度。此外，还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)作为自由基清除剂，可以保护脑组织，使其免受氧化应激损伤。研究发现，脑IR会引起氧化应激参数MDA和GSH含量以及SOD活性异常。此外，氧化应激引起正常神经元结构的破坏，尤其是线粒体结构的破坏，会进一步加剧氧化应激损伤，形成恶性循环。
　　Nrf2-ARE通路是目前发现的最重要的内源性抗氧化应激通路，其对许多神经退化性疾病有保护作用。正常生理状态下，Nrf2处于非活化状态，位于细胞质内与Kelch样ECH相关蛋白1(kelch-like ECH-associated protein1,Keap1)结合。氧化应激状态下，Nrf2活化后与Keap1解离进入细胞核与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)相互作用，调控如血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)和依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase1,NQO1)等Nrf2-ARE通路下游Ⅱ相解毒酶的转录和表达，以拮抗氧化应激损伤。既往研究发现，慢性脑缺血导致认知功能障碍大鼠海马部位Nrf2和NQO1蛋白表达异常，其引起的氧化应激损伤可以诱发海马神经元凋亡，因此推测Nrf2-ARE通路可能与VCI的发病密切相关。近期研究证实抗氧化应激治疗可以通过调节 Nrf2-ARE通路改善 VCI的学习和记忆障碍并延缓甚至逆转其进展过程，其可能成为VCI治疗的新靶点。
　　虾青素(astaxanthin,ATX)是一种天然存在的类胡萝卜素，其广泛存在于海洋生物体内。ATX具有强烈的抗氧化作用，且极易通过血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)。研究发现，预先给于ATX可以减轻氧化应激保护皮质神经元，减小局部缺血再灌注大鼠的脑梗塞体积。ATX可以通过保护海马神经元改善氯化铝导致的认知功能损伤。此外，ATX可以通过激活Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用，减轻蛛网膜下腔出血早期的脑损伤。然而，目前为止尚无研究调查ATX能否改善缺血再灌注所致认知功能损伤及其可能的调节机制。
　　最常用于复制VCI患者神经病理和行为学改变的是双侧颈总动脉闭塞(Bilateral common carotid arteries occlusion，BCCAO)模型。分离并夹闭双侧颈总动脉会引起 CBF的急剧下降，造成动物的急性脑缺血。啮齿类动物脑部有丰富的侧支循环，通过剪尾放血等手段降低血压，增加了模型的稳定性。BCCAO模型的死亡率低，术后动物会出现明显的学习和记忆功能障碍等行为学表现，并且组织病理学研究显示脑IR引起的海马神经元丢失明显。这些与人类缺血性脑卒中引起VCI的临床和病理特征相近，因此BCCAO模型是研究VCI发病机制及相应治疗较为理想的动物模型。
　　本课题以BCCAO建立的认知功能障碍小鼠为动物模型，观察 ATX对 VCI小鼠学习记忆行为学及海马部位神经元形态结构的变化；检测海马神经元超微结构、氧化应激指标及凋亡相关蛋白的变化；进一步观测Nrf2、HO-1和NQO1在海马部位表达的变化，以及ATX对Nrf2+/+和Nrf2-/-VCI小鼠的学习记忆行为和海马神经元氧化应激损伤的作用。探讨给予脑IR小鼠ATX治疗对其学习记忆功能及相应部位神经元形态结构的影响及相应机制，期望所获结果为VCI的治疗提供一定的实验依据。
　　第一部分：虾青素改善脑缺血再灌注小鼠认知功能障碍并减轻海马神经元损伤
　　目的：
　　观察给予ATX后脑缺血再灌注小鼠认知功能和海马神经元形态结构的改变。
　　方法：
　　选用雄性ICR小鼠，采用BCCAO方法建立脑缺血再灌注致认知功能障碍小鼠模型，动物分组包括假手术组(sham组)模型组(VCI组)、ATX假手术组(sham+ATX组)和ATX模型组(VCI+ATX组)。术后通过灌胃给予ATX(10 mg/kg/d)或同体积溶剂连续28天后，利用Morris水迷宫实验和尼氏染色，分析小鼠认知功能及海马神经元形态结构的变化。
　　结果：
　　1.一般情况：sham组小鼠术后一般情况较好，在给药期间体重逐渐上升。VCI组小鼠术后3天内一般情况差，体重逐渐下降，毛发无光泽。3天后状态开始逐渐好转。VCI+ATX组小鼠术后2天状态与VCI组小鼠类似，但是很快状态开始好转，一般情况介于VCI组小鼠和sham组小鼠之间。至术后4周，VCI组小鼠死亡3只，死亡率为15.79％；VCI+ATX组小鼠死亡2只，死亡率为11.11%；sham组小鼠与sham+ATX组小鼠无死亡；
　　2.Morris水迷宫
　　定位航行：各组小鼠之间的逃避潜伏期存在显著差异(P<0.01)，同时训练过程中各组小鼠的逃避潜伏期都逐渐缩短(P<0.01)。训练第2-5天，与同一天sham组小鼠相比，VCI组小鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.01)；在训练第3-5天，与同一天VCI组小鼠相比，VCI+ATX组小鼠逃避潜伏期明显缩短(第3天：P<0.05；第4天、第5天：P<0.01)。同一天中sham组小鼠与sham+ATX组小鼠的逃避潜伏期始终无明显差异(P>0.05)；
　　空间探索：各组小鼠穿越平台区域次数和在目标象限停留时间之间存在显著差异(P<0.01)。与sham小鼠相比，VCI组小鼠穿越平台区域的次数和在目标象限停留时间明显减少(P<0.01)；VCI+ATX组小鼠穿越平台区域的次数和在目标象限停留时间显著增加(P<0.01)，但尚未恢复到sham组水平(P<0.01)。sham组小鼠与sham+ATX组小鼠在目标象限停留时间无明显差异(P>0.05)；
　　可见平台：各组小鼠之间的逃避潜伏期和平均游泳速度无明显差异(P>0.05)；
　　3.尼氏染色：各组小鼠海马CA1区和CA3区锥体神经元形态结构及锥体神经元数目存在显著差异(P<0.01)。sham组小鼠海马CA1区和CA3区锥体神经元排列结构完整，整齐紧密；与sham组相比，VCI组小鼠锥体神经元结构破坏，排列稀疏，存活的数目明显减少(P<0.01)；与VCI组小鼠相比，ATX治疗后VCI+ATX组小鼠锥体神经元形态学损伤减轻、丢失减少(CA1: P<0.01; CA3: P<0.05)；sham组小鼠与sham+ATX组小鼠CA1区和CA3区锥体神经元结构及存活的锥体神经元数目未见明显差异(P>0.05)。
　　小结：
　　1.脑缺血再灌注损伤小鼠空间学习记忆功能，引起VCI。
　　2.ATX能够改善脑缺血再灌注小鼠的空间学习记忆能力障碍。
　　3.ATX发挥神经保护作用，减轻了脑缺血再灌注引起的小鼠海马神经元损伤。
　　第二部分：虾青素对血管性认知功能障碍小鼠海马氧化应激损伤的保护作用
　　目的：
　　观察给予ATX后脑缺血再灌注小鼠海马氧化应激参数及海马神经元的超微结构的改变，以及是否能够减少海马神经元的凋亡。
　　方法：
　　将雄性ICR小鼠采用BCCAO方法建立脑缺血再灌注致认知功能障碍小鼠模型，分为假手术组(sham组)模型组(VCI组)、ATX假手术组(sham+ATX组)和ATX模型组(VCI+ATX组)。采用生物化学方法检测小鼠海马氧化应激参数；透射电镜扫描方法分析小鼠海马神经元的超微结构；应用Western blot方法分析小鼠海马凋亡相关蛋白的表达。
　　结果：
　　1.氧化应激参数结果：各组小鼠海马中MDA含量、GSH含量和SOD活性存在显著差异(P<0.01)。与sham组相比，VCI组小鼠的海马中MDA含量明显升高(P<0.01)，GSH含量和SOD活性明显降低(P<0.01)；而与VCI组小鼠相比，VCI+ATX组小鼠海马中MDA含量明显降低(P<0.01)，GSH含量和SOD活性明显升高(P<0.05)。sham组小鼠与sham+ATX组小鼠海马中MDA含量、GSH含量以及SOD活性无明显差异(P>0.05)；
　　2.透射电镜扫描结果：sham组小鼠海马神经元的超微结构正常，细胞核为圆形或椭圆形，核膜清晰完整，线粒体膜清晰，结构完整，分布于细胞质中；VCI组小鼠海马神经元超微结构出现明显变化，细胞核形状不规则且核膜部分溶解，线粒体肿胀、空泡化，线粒体嵴断裂；ATX治疗后VCI+ATX组小鼠海马神经元肿胀和细胞器损伤减轻，线粒体基本恢复正常，仅有轻微肿胀和嵴断裂。sham组小鼠与sham+ATX组小鼠海马神经元的超微结构未见明显差异；
　　3.Western blot结果：各组间小鼠海马Cyt C、cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达存在统计学差异(P<0.01)。与sham组相比，VCI组小鼠海马中的Cyt C、cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达明显升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.01)；而与VCI组小鼠相比，VCI+ATX组小鼠海马Cyt C、cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达明显降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.01)。sham组小鼠与sham+ATX组小鼠海马中Cyt C、cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达未见明显差异(P>0.05)。
　　小结：
　　1.ATX可能通过其抗氧化作用改善脑缺血再灌注小鼠的认知功能障碍。
　　2.ATX能够减轻脑缺血再灌注小鼠海马神经元的超微结构损伤。
　　3.ATX通过抗氧化应激损伤减少海马神经元凋亡发挥神经保护作用。
　　第三部分：虾青素可能通过Nrf2-ARE通路对血管性认知功能障碍小鼠发挥神经保护作用
　　目的：
　　观察Nrf2-ARE通路是否参与ATX对血管性认知功能障碍小鼠神经保护作用的调节。
　　方法：
　　采用BCCAO方法建立脑缺血再灌注致认知功能障碍小鼠模型。
　　①将雄性ICR小鼠分为假手术组(sham组)、模型组(VCI组)、ATX假手术组(sham+ATX组)和ATX模型组(VCI+ATX组)，应用RT-PCR及Western blot方法分析小鼠海马部位Nrf2及相关产物HO-1、NQO1 mRNA和蛋白的表达。
　　②将Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠分为Nrf2+/+模型组(Nrf2+/+ VCI组)、Nrf2+/+治疗组(Nrf2+/+ VCI+ATX组)、Nrf2-/-模型组(Nrf2-/- VCI组)和Nrf2-/-治疗组(Nrf2-/-VCI+ATX组)，检测ATX对Nrf2+/+和Nrf2-/-VCI小鼠的认知功能，海马部位神经元丢失、氧化应激损伤及超微结构变化的影响。
　　结果：
　　1.Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠一般情况：Nrf2+/+ VCI组小鼠术后3天内一般情况差，体重逐渐下降，毛发无光泽。3天后状态开始逐渐好转。Nrf2+/+VCI+ATX组小鼠术后2天状态与VCI组小鼠类似，但是很快状态开始好转。Nrf2-/- VCI组小鼠与Nrf2-/- VCI+ATX组小鼠的一般情况类似，较Nrf2+/+VCI组小鼠状态差。至术后4周，Nrf2+/+ VCI组小鼠死亡2只，死亡率为14.29%；Nrf2+/+ VCI+ATX组小鼠死亡1只，死亡率为7.70%；Nrf2-/- VCI组小鼠死亡4只，死亡率为25%；Nrf2-/-VCI+ATX组小鼠死亡3只，死亡率为20%；
　　2.RT-PCR：sham组、VCI组、sham+ATX组与VCI+ATX组四组间小鼠海马Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA和NQO1 mRNA的相对表达存在统计学差异(P<0.01)。与sham组小鼠相比，VCI组小鼠海马中Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA和NQO1 mRNA的表达明显降低(P<0.01)；而与VCI组小鼠相比， VCI+ATX组小鼠海马Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA和NQO1 mRNA的表达明显升高(P<0.01)。sham组小鼠与sham+ATX组小鼠海马中Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA和NQO1 mRNA的表达未见明显差异(P>0.05)；
　　3.Western blot结果：sham组、VCI组、sham+ATX组与VCI+ATX组四组小鼠海马Nrf2、HO-1与NQO1蛋白的相对表达存在显著差异。与sham组小鼠海马部位Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达相比，VCI组小鼠海马中的Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达明显降低(P<0.01)；而与VCI组小鼠相比，VCI+ATX组小鼠海马Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达明显升高(Nrf2、HO-1:P<0.05; NQO1:P<0.01)。sham组小鼠与sham+ATX组小鼠海马中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达未见明显差异(P>0.05)；
　　4.Morris水迷宫
　　定位航行：各组小鼠之间的逃避潜伏期存在显著差异(P<0.01)，在训练过程中各组小鼠的逃避潜伏期逐渐缩短(P<0.01)。训练第2-5天，与同一天Nrf2+/+VCI组小鼠相比，Nrf2+/+VCI+ATX组小鼠在逃避潜伏期明显缩短(第2、3天：P<0.05，第4天、第5天：P<0.01)；在训练第3-5天，与同一天Nrf2+/+VCI组小鼠相比，Nrf2-/-VCI组小鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.05)。而与同一天Nrf2-/-VCI组小鼠相比，Nrf2-/-VCI+ATX组小鼠的逃避潜伏期未见明显变化(P>0.05)；
　　空间探索：与Nrf2+/+VCI组小鼠相比，Nrf2+/+VCI+ATX组小鼠的穿台次数和在目标象限停留时间明显增加(P<0.01)；与Nrf2+/+VCI组小鼠相比，Nrf2-/-VCI组小鼠的穿台次数和在目标象限停留时间明显减少(P<0.01)。而与Nrf2-/-VCI组小鼠相比，Nrf2-/-VCI+ATX组小鼠在目标象限停留时间未见明显变化(P>0.05)；
　　可见平台：各组小鼠之间的逃避潜伏期和平均游泳速度无明显差异(P>0.05)；
　　5.尼氏染色：各组小鼠海马CA1区存活的锥体神经元数目存在显著差异(P<0.01)。Nrf2+/+ VCI组小鼠海马CA1区锥体神经元结构破坏，排列稀疏。与Nrf2+/+VCI组小鼠相比，Nrf2+/+VCI+ATX组小鼠CA1区存活的锥体神经元形态学损伤减轻，数目明显增加(P<0.01)；与Nrf2+/+ VCI组小鼠相比，Nrf2-/- VCI组小鼠CA1区存活的锥体神经元形态结构损伤更为严重，散在分布，存活的神经元数目明显减少(P<0.01)。而与Nrf2-/-VCI组小鼠相比，Nrf2-/- VCI+ATX组小鼠CA1区存活的锥体神经元数目无明显差异(P>0.05)；
　　6.氧化应激参数结果：与Nrf2+/+VCI组相比，Nrf2+/+VCI+ATX组小鼠的海马中MDA含量明显降低(P<0.01)， GSH含量和SOD活性明显升高(P<0.01)；与Nrf2+/+ VCI组小鼠相比，Nrf2-/- VCI组小鼠海马中MDA含量明显升高(P<0.05)，GSH含量和SOD活性明显降低(P<0.05)。而与Nrf2-/-VCI组小鼠相比，Nrf2-/-VCI+ATX组小鼠海马中MDA、GSH含量以及SOD活性无明显差异(P>0.05)；
　　7.透射电镜扫描结果：Nrf2+/+VCI组小鼠海马神经元细胞核形状不规则且核膜部分溶解，线粒体肿胀，线粒体嵴断裂；Nrf2+/+VCI+ATX组小鼠的海马神经元超微结构损伤减轻，神经元线粒体仅有轻微肿胀，线粒体结构损伤减轻；与Nrf2+/+ VCI组小鼠相比，Nrf2-/- VCI组小鼠神经元海马超微结构损伤更为严重，核染色质聚集在核膜，线粒体肿胀严重，空泡化，嵴断裂严重。Nrf2-/-VCI组与Nrf2-/-VCI+ATX组小鼠海马神经元的超微结构未见明显差异。
　　小结：
　　1.ATX可以激活 Nrf2-ARE通路，增加脑缺血再灌注小鼠海马部位Nrf2、HO-1和NQO1的表达。
　　2.ATX通过激活脑缺血再灌注小鼠海马Nrf2-ARE通路，改善了认知功能并减轻其氧化应激损伤。
　　3.ATX可能通过激活Nrf2-ARE通路对VCI小鼠发挥神经保护作用。
　　结论：
　　1.脑缺血再灌注损伤导致小鼠空间学习记忆功能障碍和海马神经元损伤，是研究VCI发病机制及其相关治疗的理想模型。
　　2.ATX发挥神经保护作用，减轻了VCI小鼠学习记忆能力及海马神经元损伤。
　　3.ATX通过抗氧化应激损伤改善了VCI小鼠海马神经元的超微结构损伤及其凋亡。
　　4.ATX通过激活VCI小鼠海马Nrf2-ARE通路，改善了认知功能并减轻其氧化应激损伤，这可能是其发挥神经保护作用的机制。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分虾青素改善脑缺血再灌注小鼠认知功能障碍并减轻海马神经元损伤

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分虾青素对血管性认知功能障碍小鼠海马氧化应激损伤的保护作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分虾青素可能通过Nrf2-ARE通路对血管性认知功能障碍小鼠发挥神经保护作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:血管性认知功能障碍与模型建立和氧化应激及其相关治疗的研究进展

致谢

个人简历