不同时期蛛网膜下腔出血时活体脑片钙离子的变化

摘要

蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage)在临床上主要是因颅内病变血管破裂，大量血液进入蛛网膜下腔引起脑组织受损的临床综合征。脑血管痉挛(Cerebral vasospasm，CVS)是 SAH后一系列并发症之一，发作常见且后果严重。CVS根据发作时间可分为早发性和迟发性。早发性CVS，是指在SAH后3天内发作的脑血管痉挛。然而，这种CVS发作时间较短，且带来的脑损伤是可逆转的，故在临床中不容易发现。迟发性脑血管痉挛(Delayed cerebral vasospasm，DCVS)相比则更严重，其发作时间在72h后，它造成的脑损伤是难以逆转的，损伤更严重，致死致残率更高。若是想降低 SAH后的致死致残率，最重要的是将 SAH后的CVS控制在早期的可逆性损伤，防止其进一步发展为不可逆的DCVS。
　　钙离子作为细胞内重要的第二信使，广泛而精细的调节着神经细胞间和细胞内部的信号传导。SAH后血管壁细胞内外钙离子浓度存在变化,这表明了在 SAH后钙离子动态平衡出现了紊乱。SAH后具体的离子失衡机制尚不十分明确,然而许多因素，例如炎性因子的激活，自由基的活化和缺氧诱导等已被证明在 SAH后可改变钙通道的表达，引起胞内钙失衡。
　　目的：
　　通过线栓穿刺法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型，结合双光子显微镜活体成像技术和 Fluo4-AM钙离子染色剂，在显示器上动态观察造模大鼠神经细胞内钙离子荧光强度变化。双光子显微镜下荧光信号的强弱即反映了钙离子失衡的程度。通过研究钙离子失衡曲线，解释临床 SAH后CVS双向性的某些机制，为临床不同时期应用钙离子拮抗剂提供理论指导。
　　方法：
　　1健康的育龄3-6个月50只SD雄性大鼠，体重控制在270-330g。将50只大鼠随机分组，正常组大鼠共5只，假手术组大鼠共5只，手术造模组大鼠共40只，按造模后开颅顺序依次分为术后3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d组共8组，每组大鼠共5只。手术组行经颈内动脉血
　　管内穿刺法制作蛛网膜下腔出血模型，空白对照组不进行任何处理，假手术组不刺破大脑中动脉与前动脉分叉处直接拔出，剩余操作同手术组。
　　2大鼠清醒后于术后24h进行神经功能学评分，评分标准为Garcia法。记录大鼠评分表现并进行统计学分析。
　　3神经学评分完毕后快速断头取脑，对各组鼠脑进行大体组织形态学观察。拍照后保持脑组织活性连续震荡切片，切片完毕后用 Fluo4-AM进行荧光染色。将染色过的脑片完整置入 TPLSM的物镜下观测槽内，拍照并记录不同组脑片同一部位的钙离子分布情况差异，并用相关软件(LAS AF Lite)分析相对荧光强度。
　　4统计各组数据，数据分析使用SPSS21.0软件。各组数据平均值以均数±标准差表示，同一脑区不同时间点比较及同一时间点不同脑区比较均采用单因素方差分析(ANOVA)进行数据检验，各组间互相比较采用SNK-T检验；检验水准P<0.05时，存在统计学差异。
　　结果：
　　1大鼠蛛网膜下腔出血术后神经学评分手术组大鼠出现一系列阳性表现。假手术组上述表现均为阴性。且存在统计学差异。
　　2各组脑组织出血大体观察正常组及假手术组：未见蛛网膜下腔出血，大脑半球无水肿。术后3h：蛛网膜下腔弥漫出血，色鲜红，量较大，大脑无水肿。术后6h：蛛网膜下腔弥漫出血，出血范围较前增大，色鲜红，大脑无水肿。术后12h：蛛网膜下腔弥漫出血，出血范围较前增大，色较前暗红，术侧大脑半球可见水肿。术后24h：蛛网膜下腔弥漫出血，出血范围较前无明显变化，色较前暗红，术侧大脑半球可见水肿。术后48h：蛛网膜下腔的血液凝结成块，成暗红色，压迫脑干，术侧大脑半球可见水肿。术后72h：蛛网膜下腔出血较前减少，偶见血凝块，术侧大脑半球可见水肿。术后5d组：蛛网膜下腔出血基本吸收完毕，偶见Willis环有少量暗红色血块包裹。术后7d组：蛛网膜下腔血液基本消失。
　　3钙离子在大鼠各脑区中分布的变化统计学分析3h组：皮质的[Ca2+]i显著高于皮质下和髓质，存在统计学差别(P<0.05)。6h组：皮质的[Ca2+]i明显高于皮质下和髓质，存在统计学差别(P<0.05)。12h组：皮质[Ca2+]i>皮质下[Ca2+]i>髓质[Ca2+]i，存在统计学差别(P<0.05)。24h组：皮质[Ca2+]i>皮质下[Ca2+]i>髓质[Ca2+]i，存在统计学差别(P<0.05)。48h 组：皮质下[Ca2+]i>皮质[Ca2+]i>髓质[Ca2+]i，存在统计学差别(P<0.05)。72h组：皮质下[Ca2+]i>皮质[Ca2+]i>髓质[Ca2+]i，存在统计学差别(P<0.05)。5d组：皮质下[Ca2+]i>皮质[Ca2+]i>髓质[Ca2+]i，存在统计学差别(P<0.05)。7d组：皮质下[Ca2+]i高于皮质和髓质，存在统计学差别(P<0.05)。
　　结论：
　　1本实验采用了大鼠经颈内动脉血管内插线模型，此方法手术操作创伤小，可重复性好，较为完美的模拟了临床上前交通动脉瘤破裂导致的蛛网膜下腔出血，是目前 SAH造模的首选方法。
　　2 SAH后CVS主要分两个阶段，SAH早期CVS在出血后15min-3h内即可发生，主要因致痉因子、炎性因子等导致血管平滑肌持续性痉挛，而 DCVS多在 SAH后48-72h开始发生，主要因长期缺氧导致细胞程序性死亡导致。双光子荧光显微镜下皮质钙离子在 CVS急性期荧光强度持续性上升，直至72h最高峰，之后荧光强度开始下降。本实验大鼠脑内钙离子超载的双向性与临床 CVS双向性基本一致。
　　3 SAH后皮质钙离子荧光强度在各时间点均高于髓质，且具有统计学意义。这是因为皮质神经细胞上 T型钙通道高表达，在静息电位即可触发钙通道内流。皮质上还存在扩散性的皮质去极化抑制。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1材料

2实验动物及分组

3制作动物SAH模型

4大鼠神经行为学评分

5活体脑片制备

结果

1大鼠蛛网膜下腔出血术后一般状态观察

2大鼠蛛网膜下腔出血术后神经学评分

3各组脑组织出血大体观察正常组

4钙离子在大鼠各脑区中分布的变化及超微结构观察：

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:钙离子在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛中机制的研究进展

致谢

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