高羊茅抗渗透胁迫基因工程改良的研究

摘要

该文对高羊茅的再生转化体系的建立进行了初步研究.(1)为建立高羊茅的组织培养体系,研究了不同的种子灭菌处理方式对高羊茅种子萌发率和污染率的影响,结果显示:高羊茅种子最佳灭菌方式是将种子先在无菌水中浸泡1~3 h,然后用70％酒精灭菌30 s,无菌水冲洗5次,再用50％次氯酸钠灭菌20 min,无菌水冲洗6次.采用此灭菌方式,种子萌发率约为80％,而污染率为0％.(2)将高羊茅幼苗下胚轴接种在含有不同浓度2,4-D的MS培养基上进行愈伤组织诱导,结果表明:10 mg/L的2,4-D是下胚轴愈伤组织诱导的最佳浓度.(3)将胚性愈伤组织接种在含有不同草丁膦浓度的MS+6-BA 1 mg/L+IAA 0.1 mg/L培养基上进行愈伤组织筛选,结果显示:最佳草丁膦筛选浓度为2 mg/L.利用基因枪法,以豇豆(Vigna aconitifolia)的△<'1>-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)的突变型P5CS-F129A基因转化高羊茅的胚性愈伤组织,获得56株PCR检测为阳性的转基因植株.脯氨酸含量测定表明,转基因植株的脯氨酸含量比对照普遍高31~83％.对植株抗旱生理指标的初步检测表明,转基因植株比对照耐旱.同时,对转基因植株进行了草丁膦涂抹实验发现,转基因植株对除草剂的耐性提高.拟南芥CBF4基因为干旱专一诱导的转录因子CBF家族成员,该实验用诱导型启动子RD29A驱动,将CBF4基因插入到质粒载体pGreen0229中,获得了含有草丁瞵抗性选择标记的pGreen0229-RD29A-CBF4-DHA植物表达载体,并利用基因枪法转化高羊茅的胚性愈伤组织,得到4株PCR检测为阳性的转基因植株.来自于拟南芥的AtNHX1基因可编码Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白,而Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白可将细胞质中多余的Na<'+>排进液泡来消除Na<'+>的毒害,维持细胞的渗透平衡,提高植物的耐盐性.该实验用组成型启动子CaMV35S驱动,将AtNHX1基因插入到质粒载体pGreen0229中,得到含有草丁瞵抗性选择标记的植物表达载体pGreen0229-35S-NHX1-DHA.利用基因枪法转化高羊茅的胚性愈伤组织,得到3株转基因植株,经PCR检测表明,AtNHX1基因和bar基因已经整合到高羊茅基因组中.

目录

缩写词

摘要

Abstract

文献综述

一、植物渗透胁迫信号传导与调控

1植物渗透胁迫信号的胞间传导

2植物渗透胁迫信号的胞内传导

3转录因子及其在抗渗透胁迫基因工程改良中的应用

4渗透胁迫诱导基因及其产物

二、脯氨酸代谢与抗渗透胁迫植物基因工程研究进展

1脯氨酸的性质及其在生物体内的作用

2脯氨酸在植物体内的合成

3植物脯氨酸合成的关键酶

4脯氨酸在细胞中的定位和运输

5抗渗透胁迫植物基因工程

三、植物耐盐性研究进展

1植物对离子的选择性吸收

2盐分离子的区隔化

四、草坪草遗传育种研究进展

1草坪在园林绿化中的作用

2草坪草的分类

3提高草坪草抗渗透胁迫性的途径

4草坪草遗传育种研究进展

第一章 高羊茅植株再生体系的建立

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1高羊茅种子的最佳灭菌方式

2.2适宜的高羊茅愈伤组织诱导培养基

2.3高羊茅组培再生

3讨论与结论

3.1讨论

3.2结论

第二章 基因枪法向高羊茅导入P5CS和bar基因的研究

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果与方法

2.1不同浓度早J膦对愈伤组织的师选情况

2.2不同轰击条件下胚性愈伤组织的筛选、植株再生和PCR检测情况

2.3转基因植株草丁膦抗性

2.4转基因植株的脯氨酸含量

2.5转基因植株的抗旱性表现

2.6转基因植株叶片相对含水量(RWC)

2.7转基因植株叶片细胞膜稳定性

3讨论与结论

3.1讨论

3.2结论

第三章拟南芥CBF4基因的克隆、pGreen0229-RD29A-CBF4-DHA质粒表达载体的构建及对高羊茅的遗传转化

1材料和方法

1.1植物材料、质粒和菌株

1.2试剂和仪器

1.3拟南芥CBF4基因的克隆

1.4 pUC18-CBF4-DHA中间载体的构建

1.5 pUC18-RD29A-GFP中间载体的构建

1.6 pGreen0229-RD29A-GFP中间载体的构建

1.7 pGreen0229-RD29A-CBF4-DHA载体的构建

1.8基因枪法介导的高羊茅的遗传转化

2结果与分析

2.1拟南芥CBF4基因的克隆鉴定

2.2 pUC18-CBF4-DHA中间载体的鉴定

2.3 pUC18-RD29A-GFP中间载体的鉴定

2.4 pGreen0229-RD29A-GFP中间载体的鉴定

2.5 pGreen0229-RD29A-CBF4-DHA载体的鉴定

2.6 pGreen0229-RD29A-CBF4-DHA质粒图谱

2.7高羊茅胚性愈伤组织的筛选、植株再生和PCR检测情况

3.讨论与结论

3.1讨论

3.2结论

第四章pGreen0229-35S-NHX1-DHA质粒表达载体的构建和高羊茅的遗传转化

1材料和方法

1.1质粒和菌株

1.2试剂和仪器

1.3 pUC18-35S-NHXl-DHA中间载体的构建

1.4 pGreen0229-35S-NHXl-DHA载体的构建

1.5基因枪法介导的高羊茅的遗传转化

2结果与分析

2.1 pUC18-35S-NHXl-DHA中间载体的鉴定

2.2 pGreen0229-35S-NHXl-DHA载体的鉴定

2.3 pGreen0229-35S-NHXl-DHA质粒图谱

2.4高羊茅胚性愈伤组织的筛选、植株再生和PCR检测情况

3讨论与结论

3.1讨论

3.2结论

结论

参考文献

致谢