谷子与锈菌互作的转录组和表达谱研究及相关基因表达分析

摘要

谷子起源于中国，在我国北方干旱地区广泛种植。它具有抗旱、耐瘠薄、耐盐碱，营养价值高等优点，在我国杂粮种植结构中起到了重要的作用。由粟单胞锈菌引起的谷子锈病是一种危害严重的世界性谷子病害。在锈病流行年份，通常导致谷子减产10％～30％。本文旨在通过对接种锈菌的谷子叶片进行Illumina高通量测序，全面、系统的了解谷子转录组特性，并探索谷子“十里香”抗锈相关基因以及抗锈相关机理，为抗锈育种提供新参考。
　　本研究采集接种锈菌0h、24 h和48 h的谷子“十里香”叶片样本后提取RNA，利用Illumina GAⅡx进行Solexa测序，共得到8，439，350条clean reads。将clean reads用SOAPdenovo软件进行从头组装，得到32538个Unigenes。将组装好的32538条Unigene进行注释，总共有23881条Unigene获得了注释，其中，有23811条Unigene注释到Nr数据库，16350条Unigene注释到SwissProt数据库，12223条Unigene注释到KEGG数据库，9250条Unigene注释到COG数据库，2240条Unigene注释到GO数据库。根据得到的注释信息初步明确了228个与防御机制有关的基因，448个与次生代谢物的生物合成，运输及分解有关的基因，5个与免疫系统过程有关的基因，以及161个与刺激响应有关的基因，对进一步分析谷子与锈菌非亲和互作基因表达模式，揭示谷子与锈菌相互作用机制奠定了基础。
　　在转录组测序的基础上，又使用Illumina HiSeqTM2000对接种锈菌0h、24h和48 h的谷子“十里香”叶片进行了数字基因表达谱测序。构建的3个数字化表达谱文库分别得到3397826、3394432和3238980个clean tag。将包含32538个unigene的转录组数据库作为参考数据库。3个数据库的clean tag比对上了参考基因数据库的分别有2048811、2083275和2024290个，比对上的unigene为13806、16005和15426个，unambiguous tag比对上的unigene有13709、15887和15322个，占总参考基因数目的42.13％、48.83％和47.09％。将3个表达谱文库中unambigious tag匹配上的参考基因两两作对比筛选差异表达基因，其中24 h与0h相比有4542个差异表达基因，48 h与0h相比有5112个差异表达基因，48 h与24 h相比有968个差异表达基因。用GO分类对差异表达基因进行功能分类，发现“核糖核蛋白复合体”和“高分子配合物”是细胞组分中显著富集最明显的GO term;“结构分子活性”和“有机物质代谢过程”是分子功能中显著富集最明显的GO term;“细胞的氨基酸代谢过程”是生物学过程中显著富集最明显的GO term。对差异表达基因的KEGG pathway显著性富集分析发现，在上调路径中“核糖体”是最显著富集的路径，接下来依次是:“代谢途径”、“苯丙素类生物合成”、“苯基丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成”、“精氨酸和脯氨酸代谢”、“来源于莽草酸途径的生物碱生物合成”、“类固醇生物合成”、“苯丙烷生物合成”、“类黄酮生物合成”等。通过以上分析，筛选出一些与谷子抗锈相关的蛋白激酶、转录因子以及病程相关蛋白等基因以及植物-病原菌相互作用路径、苯丙烷生物合成路径等与谷子抗锈相关的路径，并初步推测其抗锈机制。通过转录组和表达谱分析，选取了34个基因，利用实时荧光定量PCR进行验证，并将定量结果与表达谱测序结果进行对照，验证结果的准确性。结果表明，两种方法的结果一致性达到97.06％，说明结果的可信度较高。接着，利用定量PCR比较这34个基因在抗病谷子品种“十里香”和感病品种“豫谷1号”接种锈菌后的表达情况。发现这些基因在抗性材料中的表达强度明显高于感病材料，其中Unigene5531(GLU)、Unigene15666(CHT)、Unigene25719(PER1)、Unigene734(MKK4)、Unigene12730(WRKY7)、Unigene30025(WRKY62)、Unigene30953(WRKY70)、Unigene11273(MYB)、Unigene29832(GST24)、Unigene7613(GST29)、Unigene30834(GST)、Unigene25649(SGT)、Unigene23762(PAL)、Unigene10309(HR)、Unigene13691(XA26)、Unigene14926(NPR1)、Unigene32120(RPS1/RPM2)、Unigene16195(DR)和Unigene1811(DR)的表达差异尤其明显。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 谷子锈病研究概述

1．1．1 谷子锈病病原菌

1．1．2 谷子锈病的发生及其危害

1．1．3 谷子锈病发生的流行规律及其发病条件

1．1．4 谷子锈病的防治

1．2 病原菌与寄主间的相互作用

1．2．1 病程相关基因

1．2．2 蛋白激酶

1．2．3 转录因子

1．2．4 植物抗病基因

1．3 第二代测序技术

1．3．1 第二代测序技术概况

1．3．2 RNA-Seq技术

1．3．3 DGE技术

1．3．4 RNA-seq与DGE的关系

1．4 实时荧光定量PCR

1．4．1 qRT-PCR的标记方法

1．4．2 qRT-PCR内参基因的选择

1．4．3 qRT-PCR技术的应用

1．5 研究目的及意义

2 谷子转录组测序及生物信息学分析

2．1 实验材料

2．1．1 主要仪器设备

2．1．2 主要试剂

2．1．3 谷子品种及菌种

2．2 实验方法

2．2．1 材料处理和取样

2．2．2 RNA提取及质量检测

2．2．3 转录组文库构建及测序

2．2．4 测序数据的生物信息学分析

2．3 结果与分析

2．3．1 RNA样品的质量检测

2．3．2 测序产量和组装质量统计

2．3．3 Unigene的功能注释和功能分类

2．3．4 预测编码蛋白框CDS

2．4 小结

3 谷子响应锈菌侵染的数字基因表达谱构建及分析

3．1 实验材料

3．1．1 主要仪器设备

3．1．2 主要试剂耗材

3．1．3 谷子品种及菌种

3．2 实验方法

3．2．1 材料处理和取样

3．2．2 RNA提取及质量检测

3．2．3 表达谱文库构建及测序

3．2．4 数字化基因表达谱信息分析流程

3．3 结果与分析

3．3．1 RNA样品的质量检测

3．3．2 表达谱测序结果与分析

3．3．3 谷子抗锈相关基因的识别

3．4 小结

4 谷子抗锈相关基因的筛选和初步验证

4．1 试验材料

4．1．1 主要仪器设备

4．1．2 主要试剂

4．1．3 谷子品种及菌种

4．2 试验方法

4．2．1 材料处理和取样

4．2．2 RNA提取及质量检测

4．2．3 引物设计

4．2．4 内参基因的选择

4．2．5 第一链cDNA的制备

4．2．6 荧光定量PCR检测

4．3 结果与分析

4．3．1 RNA样品的质量检测

4．3．2 候选基因表达分析

4．4 小结

讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间取得的科研成果清单