番茄灰霉生防菌B21的分子鉴定及其抗菌蛋白的分离纯化

摘要

该研究以从植物叶片上筛选出的具有强烈抑制番茄灰霉病生长并产生大量颉颃物质的颉颃细菌B21为实验材料.通过部分田间试验、B21的分子鉴定、对抗菌蛋白的特性分析和抗菌蛋白的分离纯化,主要明确了以下问题:利用B.subtilis B21菌株的培养液进行田间防病试验结果表明,颉颃细菌B21悬浮液对番茄灰霉病有较好的防治效果,其发酵液原液、5倍稀释液和10倍稀释液三个处理在叶期的防病效果分别为67.21％、63.57%和51.02%,均高于对照药剂多菌灵500倍液(42.26%),达极显著水平.其中B21发酵液5倍稀释处理的防效与10倍处理的防效差异显著,而与发酵原液处理的防效处于同一水平.在果期能显著降低病果率,B21发酵液原液、5倍稀释液和10倍稀释液三种浓度处理的病果率分别为7.5%、9.6%和13.23%.该实验在原来研究的基础上利用PCR技术对菌株B21 16S rDNA序列作全序列分析,序列结果在GeneBank中进行Blast同源序列检索,再用DNAStar软件与Bacillus属的其它种进行同源性分析,结果显示B21与已报道的B.subtilis16S rDNA序列(登陆号AY172513)有99.93%的相似性,且两者在系统发育树中处于同一个分支.确定B21为B.subtilis的一个菌株.利用饱和硫酸铵盐析,获得粗提蛋白.该颉颃蛋白80℃处理30 min后,活性显著下降,只是保持部分颉颃活性,100℃处理30 min后丧失颉颃活性,表明不耐高温;对胰蛋白酶和蛋白酶K部分敏感,对链霉蛋白酶不敏感,对氯仿敏感;作用活性pH值范围在5~11之间.采用抑菌活性检测和SDS-PAGE跟踪检测,通过Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱层析和DEAE Fast Flow离子交换层析等方法从B21的发酵液中纯化了抗菌蛋白,通过SDS-PAGE电泳分析,确定该蛋白质的分子量为43KD.

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

1引言

2材料和方法

2.1材料

2.1.1供试菌株

2.1.2供试植物材料

2.1.3培养基

2.1.4试剂

2.1.5仪器

2.2实验方法

2.2.1颉颃菌B21防治番茄灰霉病的田间小区试验

2.2.2颉颃菌B21的16S rDNA序列分析

2.2.3抗菌蛋白的特性分析

2.2.4抗菌蛋白的分离纯化

2.2.5纯化样品的理化性质研究

3结果与分析

3.1颉颃菌防治番茄灰霉病的田间小区试验结果

3.2颉颃菌B21的16S rDNA序列分析结果

3.2.1菌株DNA提取

3.2.2 PCR扩增

3.2.3 Blast分析

3.3抗菌蛋白的特性分析

3.3.1硫酸铵分级盐析条件的确定

3.3.2热稳定性试验

3.3.3对蛋白酶的稳定性

3.3.4对氯仿的稳定性

3.3.5对pH值的稳定性

3.4抗菌蛋白的分离纯化

3.4.1 Sephacryl S-200 HR柱层析

3.4.2 DEAE Fast Flow离子交换层析

3.5纯化样品的理化性质研究

3.5.1紫外吸收

3.5.2蛋白质浓度的测定

3.5.3聚丙烯酰胺凝胶电泳测得纯化蛋白质的分子量

4讨论

4.1关于菌株鉴定的讨论

4.2枯草芽孢杆菌在植物病害防治上的应用

4.3芽孢杆菌生防作用机理

4.4抗菌蛋白分离纯化

4.5关于蛋白质浓度检测的讨论

4.6关于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的讨论

4.7芽孢杆菌对植物病害生物防治存在的问题和未来研究方向

4.7.1存在问题

4.7.2未来研究方向

5结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简历

附件

致谢