猪黑素皮质素受体1（MC1R）基因与毛色表型相关及5'UTR变异研究

摘要

毛色是一种可利用的遗传标记，它在确定杂交组合、品种纯度和亲缘关系方面均有一定用途。黑素皮质素受体1(MCIR)基因是毛色遗传的候选基因。本试验利用Bioedit软件对猪MCIR基因编码区序列作了比对，结果发现长白(AY365253)、大白(AY365255)MClR基因894位点(以猪序列AF326520序列为参考标准)存在CCC插入(nt894insccc)，1197位点存在G1197A突变。但是Kijas等报道大白和长白894位点存在CC插入；比对结果还发现杜洛克存在两处单核苷酸多态，即C1318T和G1554A，但并非所有杜洛克均发生此两处突变，如AY916524不存在C1318T，AY916523不存在G1554A。与Kijas等人报道的所有杜洛克均存在C1318T和G1554A有出入。因此，本实验通过GenBank上已发表的猪的序列(AF326520)，设计了4对引物对编码区进行扩增，应用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术对编码区变异情况进行研究。结果发现：长白、大自所有个体均存在nt894insCC和G1197A突变；杜洛克所有个体均存在C1318T和G1554A突变。所有突变位点未检测到杂合子。长白、大白nt894insCC使编码蛋白过早终止于56密码子处，该突变使G1197A突变失去意义，因此推测nt894insCC与长白、大白的白毛色存在相关。杜洛克C1318T突变，G1554A突变分别导致Ala164Va1和Ala243Thr氨基酸的改变，为功能性丧失突变，使棕色素/黑色素比例增加，最终导致红毛色的产生。为进一步研究MClR基因多态与猪毛色变异的关系，又对其5’非翻译区(5’UTR)进行多态性筛查。根据猪序列(AF326520)设计引物并进行扩增，每个品种选取两个个体进行测序，结果发现杜洛克个体存在G668C突变。PCR-RFLP统计结果表明所有杜洛克个体均存在G668C突变且未检测到杂合子。G668C突变可能会在转录水平和转录后水平影响MCIR的表达，进而影响毛色的变异。因此推测，G668C、C1318T和G1554A突变与杜洛克的红毛色存在相关。最后，又对物种间MCIR基因5'UTR的遗传距离进行了分析：根据牛序列(AF445641)设计引物并扩增不同毛色山羊品种和绵羊品种5’UTR，经测序发现：绵羊与山羊品种之间变异位点较多，共发现T86G,G104A，127缺失G, C129T,233-236缺失GGAC，G296A，C353T，G544A，C582T，A583G，C594A 11个多态位点。绵羊品种之间萨伏克与其余绵羊品种间相比较存在G296A，A544G，T129C3个多态位点。所发现的多态位点为进一步研究其遗传学效应奠定了基础。不同毛色山羊品种间未发现变异。对测序获得的山羊、绵羊、猪MCIR基因的5'UTR和从Genbank中获得的牛、马、人、鼠、长毛象、狗、河豚、鸡、斑马鱼、莫桑比克罗非鱼的5'UTR共13个物种的5'UTR序列利用Lasergene6进行系统聚类分析。聚类结果表明：鼠、人类、长毛象、猪聚为一类；山羊、绵羊、牛聚为一类；狗、马、鸡、莫桑比克罗非鱼、斑马鱼、河豚各聚一类，与传统的动物学分类一致。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1毛色遗传的研究现状

1.2 MC1R基因的研究

1.2.1 MC1R基因的作用机理

1.2.2 MC1R基因的研究现状

1.3试验中所涉及的分子标记方法

1.3.1单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,缩写SNP)

1.3.2限制性片断长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism缩写RFLP)

1.3.3单链构象多态性(Single-Strand Conformational Polymorphism缩写SSCP)

1.4高GC含量PCR

1.5本研究目的意义及主要内容

1.5.1本研究目的意义

1.5.2研究的主要内容

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1试验猪样品来源及采样方法

2.1.2药品种类

2.1.3试剂的配制及保存

2.1.4主要仪器设备

2.1.5主要分析工具软件及在线分析网站

2.2试验方法

2.2.1猪耳及尾组织DNA的提取

2.2.2编码区序列比对

2.2.3引物的设计与合成

2.2.4 PCR扩增

2.2.5 PCR-RFLP确定MC1R基因编码区基因型

2.2.6 PCR-SSCP确定MC1R基因编码区基因型

2.2.7不同毛色品种猪5'UTR多态性筛查

2.2.8物种间MC1R基因5'UTR系统聚类分析

3结果分析

3.1猪样品DNA提取结果

3.2编码区序列比对结果

3.3 PCR-RFLP确定编码区基因型

3.3.1 PCR扩增结果

3.3.2 G1197A和G1554A突变位位点PCR-RFLP分析结果

3.4 PCR-SSCP确定MC1R基因编码区基因型

3.4.1 PCR扩增结果

3.4.2 nt894insCCC和C1318T突变位点SSCP分析结果

3.4.3序列测定

3.5长白、大白、杜洛克猪MC1R基因5'UTR多态性分析

3.5.1 PCR扩增结果

3.5.2扩增片断序列的测定

3.5.3 PCR-RFLP确定MC1R基因5'UTR基因型

3.6物种间MC1R基因遗传距离和系统聚类图

3.6.1不同山羊和绵羊品种5'UTR扩增

3.6.2不同毛色品种山羊、绵羊5'UTR扩增片断序列的测定

3.6.3物种间MC1R基因5'UTR系统聚类分析结果

4讨论

4.1样品DNA的提取

4.2 PCR扩增

4.2.1模板的质量

4.2.2引物的设计、使用和保存

4.2.3引物和dNTP的浓度

4.2.4退火温度

4.2.5退火时间

4.2.6循环数

4.2.7高GC含量PCR

4.3影响SSCP的因素

4.3.1 PCR扩增产物

4.3.2聚丙烯酰胺凝胶成分和浓度

4.3.3电泳条件

4.4 MC1R基因多态与猪毛色的关系

4.4.1 MC1R基因多态

4.4.2 G668C、C1318T和G1554A突变与杜洛克的红毛色存在相关

4.4.3 nt894insCC与长白、大白白毛色存在相关

4.5 5'UTR G296A,A544G和T129C突变可能与萨伏克黑头和四肢表型存在相关

5结论

参考文献

在读期间发表的论文

作者简历

致 谢