拟南芥磷脂酶C调节花粉萌发和生长的功能研究

摘要

肌醇磷脂依赖的磷脂酶C(PI-PLC，简称PLC)是肌醇磷脂信号系统中的一个关键酶，它水解PIP<,2>(Phosphatidylinositol bisphosphate)生成两个第二信使分子，1，4，5-三磷酸肌醇(IP<,3>)和二酰甘油(DAG)，通过这两个信使分子调节一系列蛋白的活性，如酶、受体、转运蛋白、细胞骨架成分等，从而在细胞的生长、增殖、代谢、分泌和收缩的信号转导中起作用。研究表明，植物PLC基因在植物对外界刺激如渗透、胁迫、ABA、光、重力、病原侵染、授粉以及缺氧等的应答和生理过程中起作用。拟南芥基因组测序工作完成后，序列信息表明拟南芥中可能存在14种不同的PLC和类PLC亚型的基因。研究不同PLC亚型参与调节的生理过程，可以为PLc的功能研究和作用机制的探讨提供重要的依据。 本试验以来自salk库中的拟南芥PLC一个亚型的基因(AtPLC14)缺失突变体为材料，以野生型拟南芥为对照，检测到了突变体中花粉萌发过程和果实成熟过程生理表型的变化，为该PLC亚型参与花粉萌发和生长的过程提供了分子水平的invivo证据。 首先用PCR的方法筛选鉴定了来自salk库的拟南芥AtPLC14的T-DNA插入突变纯合体，并通过RT-PCR检查证实该突变体AtPLC14基因表达缺失；以野生型拟南芥(Columbia生态型)做对照，检测了突变体花粉的表型和萌发特征，发现AtPLC14的缺失突变体花粉活力下降，其萌发率比野生型下降了约30％，花粉管生长速度延迟约8小时，并且长角果成熟延迟7～9天，收获率降低48.2％；其次构建了一系列相关载体并进行了拟南芥的遗传转化，发现将AtPLc14的cDNA重新转到突变体后，突变表型得到恢复，且GuS报告基因的表达证实AtPLC14基因在花粉里有较高的表达。上述试验数据表明，拟南芥AtPLC14亚型参与了对花粉萌发与花粉管生长的调节，并影响了拟南芥长角果的发育。这些结果为进一步研究AtPLC14的作用机制奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写表

声明

1引言

2拟南芥AtPLC14基因T-DNA不同位点插入突变体鉴定及初步组织表达分析

2.1材料和方法

2.1.1植物材料

2.1.2仪器设备

2.1.3试剂及培养基配方

2.1.4拟南芥的种植

2.1.5拟南芥AtPLC14基因T-DNA插入突变体纯合体的鉴定

2.1.6 AtPLC14基因不同位点插入突变体的RT-PCR分析

2.1.7 AtPLC14不同组织表达水平的分析

2.2结果与分析

2.2.1 AtPLC14 T-DNA插入突变体的PCR鉴定及RT-PCR分析

2.2.2 mg1突变体插入T-DNA拷贝数的鉴定

2.2.3 At PLC14基因的组织表达分析

3 AtPLC14基因表达缺失突变体mg1的表型分析

3.1材料和方法

3.1.1植物材料

3.1.2拟南芥的种植及表型观察

3.1.3花粉的收集

3.1.4花粉体外萌发试验

3.1.5花粉细胞核的DAPI(4，6-二氨基-2-苯基吲哚)染色

3.1.6花粉的Alexander染色(Alexander 1969)

3.1.7花粉的TTC染色法

3.1.8花粉可育性的检测—种荚形状及数量统计

3.2结果与分析

3.2.1 mg1突变纯合体的长角果成熟延迟

3.2.2 mg1突变体花粉生活力水平降低

4 AtPLC14基因的克隆，相关载体构建

4.1材料和方法

4.1.1菌株、酶、质粒、试剂

4.1.2培养基

4.1.3 E.coli感受态细胞的制备和转化

4.1.4农杆菌感受态细胞的制备和转化

4.1.5质粒的提取

4.1.6 AtPLC14启动子和PLC 14的cDNA的克隆测序

4.1.7载体构建过程

4.2结果与分析

4.2.1 pCAMBIA1300-ProAtPLC14::GUS的载体构建

4.2.21300-PPr::Rs1-NOS与1300-PPr::Rs2-GFP-NOS的载体构建

4.2.3 pCAMBIA1300-ProAtPLC14::Ps1-NOS的载体构建

5拟南芥的遗传转化

5.1材料和方法

5.1.1转化介质的配制

5.1.2拟南芥的转化

5.1.3转基因种子的收获以及转基因苗的筛选与鉴定

5.1.4 GUS染色液的配制

5.2结果与分析

5.2.1拟南芥的遗传转化阳性株的筛选和鉴定

5.2.2转基因植株的初步表型确定

5.2.3 GUS组织定位的结果

6讨论

6.1花粉发育的研究方法

6.1.1花粉的离体萌发

6.1.2花粉表型的检测方法

6.1.3花粉活力的染色检测

6.2 AtPLC14参与了花粉萌发和生长的生理过程

7结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢