生防萎缩芽孢杆菌CAB-1菌株几丁质酶基因的克隆和原核表达

摘要

随着植物病原菌抗药性和农药残留等问题的日益突出,利用微生物杀菌剂防治植物病害已成为研究热点之一。几丁质酶能够有效降解高等真菌细胞壁中的几丁质成分,从而抑制或杀死多种植物病原菌,因此,筛选具有几丁质酶活性的拮抗微生物,一方面可以直接利用其抑制植物病原菌的生长,研发高效微生物杀菌剂;另一方面可以通过克隆几丁质酶基因,为转基因植物和构建生防工程菌株提供抗病基因资源。
　　 1.本研究通过平板透明圈法从大量生防菌中筛选获得一株具有几丁质酶活性的细菌菌株CAB-1,该菌株对番茄灰霉病菌等多种植物病原真菌表现较强的拮抗活性。通过生理生化、16S rDNA和gyrB基因序列测定,将菌株CAB-1鉴定为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。
　　 2.通过对菌株CAB-1全基因组序列进行分析和功能预测,发现该菌株存在两个几丁质酶编码基因,分别命名为chit1和chit2。通过PCR技术从菌株CAB-1中克隆出这两个几丁质酶的编码基因。其中chit1基因全长为1791 bp,编码596个氨基酸,预测分子量为65.8 Kda,chit2基因全长为2091 bp,编码696个氨基酸,预测分子量为77.8 KDa,两个几丁质酶基因序列间隔64 bp。序列对比发现,菌株CAB-1中的chit1几丁质酶核苷酸序列与萎缩芽孢杆菌模式菌株1942菌株中的几丁质酶基因chi(CP002207.1),以及枯草芽孢杆菌的几丁质酶基因chi(AF069131.1)的同源性都高达99％;chit2几丁质酶基因与短小芽孢杆菌几丁质酶操纵元序列(DQ859055.1)同源性为96%。对氨基酸序列分析发现,Chit1蛋白N端有36个氨基酸的信号肽序列,其后有三个保守结构域包括几丁质催化域、FⅢ纤连蛋白结构域(Fibronectin typeⅢ like domain)、几丁质结合域(CBD),属于18家族几丁质酶中的B亚族。Chit2编码的氨基酸序列N端也存在一个信号肽序列,长度为32个氨基酸,且该蛋白也属18家族几丁质酶,但只有催化域,缺乏FⅢ纤连蛋白结构域和几丁质结合域。
　　 3.将chit1和chit2基因转入大肠杆菌中进行原核表达,SDS-PAGE可检测到预测大小的目的蛋白,并且利用平板透明圈法显示chit1和chit2基因的原核表达产物均表现出几丁质酶活性,利用DNS法测得chit1原核表达产物的几丁质酶活性强于chit2。其中chit1的原核表达产物对番茄灰霉菌分生孢子的萌发具有较强的抑制作用,而chit2的原核表达产物对番茄灰霉菌没有明显的抑制作用。对chit1原核表达条件进行优化,发现在30℃下振荡培养,IPTG浓度为0.5 mmol/L时其目的蛋白表达量最高。