Mutator转座子介导的玉米叶色突变体侧翼序列的克隆及遗传分析

摘要

玉米基因组测序完成为玉米功能基因组学研究开辟了新的篇章,也为玉米种质资源创制和分子育种奠定了重要基础。突变体是反向遗传学研究进行基因分离、克隆和功能解析的最理想、最有效的材料。Mutator(Mu)转座子是玉米的内源转座子,具有高诱变特点,极易获得遗传多样的突变体。与此同时转座子标签技术是开展玉米功能基因组学研究的重要策略。
　　 本研究中以含活性MuDR转座子的W22::Mu为父本,与优良自交系综31杂交,经多代自交或回交,筛选出了Mu转座子诱导的叶色突变体,作为本研究Mu转座子标签技术的分离叶色突变目标基因的材料。利用改良的MuTail-PCR、MuAFLP和illumina测序方法,分离Mu因子插入位点侧翼序列,并对Mu因子插入位点进行了真实性验证和生物信息学分析,获得了以下结果:
　　 1、共获得含Mu-TIR.的侧翼序列129条,其中重复序列36条,特异性序列93条。特异性序列中插入位点为多拷贝序列的有18条占18.9％,对其余75条特异性单拷贝序列在玉米染色体上的分布进行定位:其中第4、第6和第7染色体分布较少,所占比例分别为2.67%,1.33%和4%,合计为8%;第2、第5、第8和第9染色体分布较多,所占比例分别为13.33%,13.33%,16%和18.67%,合计为61.33%。这75条序列平均长度约为600bp,其中在200～400bp范围内有6条序列,在400～600bp范围内有26条序列,在600～1000bp范围内有43条序列,没有低于200bp的序列。
　　 2、对75个9bp正向重复序列进行分析,发现了5个Mu因子插入热点序列:GTCACGCAC,GTTAGCAGA,CHTTYCTAG,ATTCTCTAK和TGCAGTACA。
　　 3、对叶色突变群体利用MuAFLP的方法分离侧翼序列,对获得的差异条带进行回收、测序,将测序结果去载体和Mu-TIR序列,共获得14条Mu插入位点的目标序列,去除冗余序列2条和重复序列8条,获得4条目标序列作为进一步研究的对象,经验证共有2条为真实性插入位点。
　　 4、PPR突变位点,定位在玉米第6染色体上,Mu因子插入在基因5’UTR区,位于第121个碱基和第122个碱基之间;此突变位点的分离群体基因型比例符合孟德尔分离规律,但与表型不关联。
　　 5、PB1突变位点,定位在玉米第5染色体上,Mu因子插入在基因第1外显子中;突变位点其分离群体基因型比例符合孟德尔分离规律,但与表型不关联。