重组猪肺表面活性蛋白A在体外抑制PRRSV感染宿主细胞的研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的妊娠母猪发热流产,仔猪与育肥猪呼吸障碍为特征的传染病,是目前危害养猪业最为严重的传染病之一,给我国的养猪业带来了巨大的经济损失。国内外学者已经对PRRS进行了大量的研究,对其致病机理等方面有了深入的了解。
　　 PRRSV是RNA病毒,感染的主要途径为呼吸道,其宿主细胞为猪肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar macrophage,PAM),病毒在不同亲代之间变异较大。由于没有有效的疫苗控制病毒的感染,所以动物体的天然免疫系统对该病毒的抵御作用显得异常重要。天然免疫系统不仅能及时清除外来的病毒,同时也可促进或激活机体的获得性免疫系统。已有研究表明,SP-A分子中含有能够识别病毒表面多糖分子的结构域,具有一定的抗病毒作用。所以在目前尚无有效的PRRS疫苗的情况下,通过研究SP-A抗PRRSV感染宿主细胞的作用,从先天性免疫方面为抗PRRSV感染的研究提供了新的途径。
　　 因此,为研究SP-A是否具有抗PRRSV感染宿主细胞的活性,我们制备了重组猪SP-A蛋白,并在体外进行了与PRRSV相互作用的研究。本实验首先采用PCR方法从含有猪SP-A基因的质粒中扩增SP-A基因,并将其插入到含有人CD5信号肽序列的真核表达载体pcDNA3.1A-CD5中,构建成SP-A基因的真核分泌型表达载体pcDNA3.1-CD5-SPA/MH。将重组表达载体通过磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western blot方法鉴定表达产物,采用Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析法从培养基中分离和纯化重组SP-A蛋白,通过ELISA方法检测SP-A蛋白与PRRSV的结合活性。将SP-A蛋白与PRRSV孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,感染72 h后测定病毒滴度,分析重组猪SP-A蛋白对PRRSV感染的抑制作用。
　　 结果表明构建的真核表达载体能够介导SP-A基因在HEK293T细胞中进行分泌表达;表达的重组猪SP-A蛋白能够与PRRSV进行剂量依赖性结合;用重组猪SP-A蛋白与PRRSV进行孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,结果显示SP-A处理的PRRSV感染细胞后的病变程度显著低于对照组。感染72 h后,SP-A处理组的PRRSV在MARC-145细胞和PAM细胞的滴度显著低于SP-A非处理组。综上所述,可以得出以下结论:重组猪SP-A蛋白在体外对PRRSV的感染有显著的抑制作用,具有抗PRRSV的活性。