犬细小病毒NS1非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究

摘要

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一种急性传染病。此病主要表现急性出血性肠炎和急性心肌炎,传染性强,发病率和死亡率高,是一种危害犬,特别是幼犬的一种重要的传染性疾病。近20多年来,国内外学者对犬细小病毒病的流行病学、病原生物学、诊断和防治方面进行了大量研究,但是,目前对犬细小病毒病的发病机制了解甚少。
　　 已有研究证实,在体外CPV感染猫肾细胞NLFK和犬纤维瘤细胞A72可以引起细胞凋亡,在体内CPV感染可诱导肠粘膜上皮细胞的凋亡和坏死,进而引起继发感染。为了研究犬细小病毒非结构蛋白NS1在CPV引起宿主细胞凋亡中的作用,初步探讨CPV引起细胞凋亡的机制,需要表达NS1蛋白。为获得具有生物活性的NS1蛋白,我们选用真核表达系统,把重组质粒转染入细胞瞬时表达NS1蛋白。
　　 本实验首先参考GenBank已发表的犬细小病毒非结构蛋白NS1基因的序列,设计2对引物,以犬细小病毒的基因组为模板,采用PCR方法扩增NS1编码基因,将该基因片段克隆到pcDNA3.1A载体中,构建成下游融合6×His的融合表达载体pcDNA-NS1/His和非融合表达载体pcDNA-NS1,融合表达载体pcDNA-NS1/His通过转染HEK293FT细胞瞬时表达NS1重组蛋白,用Western-blot检测以确定重组NS1蛋白能否在真核细胞中进行表达。然后用CPV感染和用pcDNA-NS1表达载体转染F81宿主细胞,通过AnnexinV/PI双染法检测磷脂酰丝氨酸外翻和通过化学发光法检测caspase-3/7活性,分析感染CPV或转染NS1基因对F81宿主细胞凋亡的影响。
　　 结果表明,本实验扩增的NS1基因序列与GenBank的序列一致,构建的表达载体结构正确,并能够介导NS1基因在真核细胞中表达。感染CPV和转染NS1基因均能诱导F81细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和明显提高细胞内caspase-3/7的活性,表明CPV和NS1蛋白均能引起细胞的凋亡。综上所述,犬细小病毒的NS1非结构蛋白可诱导细胞凋亡,这为进一步研究CPV诱导细胞凋亡的分子机制提供了重要的实验基础。