转SsBHMT基因拟南芥的耐缺硫性评价及其导入基因的表达分析

摘要

硫是植物的必须营养成分之一，硫供应不足不仅影响到作物的产量而且影响到品质。甲硫氨酸(Met)是一种含硫的α-氨基酸，它是构成人体的必需氨基酸之一，因其不能在哺乳动物体内自身生成，所以必须由外部获得。甲硫氨酸的含量也经常限制农作物的营养价值。甲硫氨酸除了营养方面的重要性外，也参与起始mRNA的翻译，蛋白质的合成，以及在许多细胞代谢过程中起到调节作用。甲硫氨酸不仅是植物中细胞的主要代谢产物，而且在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)作用下生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。SAM是生物内主要的甲基供体，参与乙烯、多胺、木质素和渗透调节剂的生物合成，并且与植物抗逆反应等关系密切。甜菜碱高半胱氨酸-S-甲基转移酶(BHMT)是一种甲基代谢酶，存在于动物和微生物体内，催化甜菜碱向高半胱氨酸转移甲基，生成甲硫氨酸。因此本研究分析了转化SsBHMT基因拟南芥的耐缺硫性、导入基因的表达、甲硫氨酸含量，希望为研究植物体内甲硫氨酸的合成与代谢机制、探讨SsBHMT基因在植物抗缺硫胁迫中的作用提供理论依据。具体试验如下:
　　 1.表型观察发现，在缺硫胁迫条件下，转基因拟南芥叶片枯黄程度低于野生型;正常条件下，无论是否加甜菜碱，转基因拟南芥比野生型长得健壮，根密度也高;正常或缺硫条件下加入甜菜碱，转基因型根长明显大于野生型。
　　 2.生理生化分析表明，正常与缺硫条件下转基因拟南芥的SOD活性都比野生型要高;缺硫条件下，转化苗的叶绿素含量比野生型高，丙二醛(MDA)含量比野生型低;在缺硫条件下，加入甜菜碱后转基因型SOD活性及叶绿素含量都比野生型要高。
　　 3.免疫分析导入基因的表达发现，目的蛋白在缺硫以及添加甜菜碱条件下的转化苗中表达没有明显的变化;在不同时间点缺硫和缺盐胁迫的转化苗中也无明显的变化;50 mmol/L NaCl胁迫，目的蛋白的表达量与正常相比并没有表观上的变化，而75 mmol/L NaCl处理使目的蛋白的表达量减弱;在正常条件下加入甜菜碱目的蛋白表达降低，50 mmol/L NaCl条件下加甜菜碱的与不加甜菜碱相比没有明显变化，但75 mmol/L NaCl条件下加入甜菜碱目的蛋白表达量升高。
　　 4.初步测定野生型与转基因型拟南芥种子的甲硫氨酸含量表明，转基因型拟南芥种子甲硫氨酸含量变化幅度比野生型要大，正常条件下转基因型拟南芥种子的甲硫氨酸含量明显高于野生型。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 甲硫氨酸在植物中的合成代谢

1．1．1 甲硫氨酸在植物中的重要作用

1．1．2 植物中甲硫氨酸的合成途径

1．1．3 植物中甲硫氨酸的代谢途径

1．1．4 甲硫氨酸再循环途径

1．1．5 提高植物甲硫氨酸含量的研究现状

1．2 硫素营养对作物的影响

1．2．1 硫的营养功能

1．2．2 主要作物的缺硫症状

1．2．3 土壤硫素状况

1．2．4 硫肥应用的展望

1．2．5 植物硫代谢和耐缺硫胁迫的研究进展

1．3 SsBHMT简介

1．4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 拟南芥的种植

2．2．2 拟南芥表型和生理指标检测

2．2．3 转基因拟南芥不同处理条件下的Western blot分析

2．2．4 不同处理条件下拟南芥种子中的甲硫氨酸含量测定

3 结果与分析

3．1 转基因拟南芥在缺硫胁迫条件下的表型观察

3．1．1 叶片表型观察

3．1．2 根长表型观察

3．2 缺硫条件下10f的生理检测

3．2．1 缺硫胁迫对10f超氧化物歧化酶活性的影响

3．2．2 缺硫胁迫对10f丙二醛(MDA)含量的影响

3．2．3 缺硫胁迫对10f叶绿素含量的影响

3．3 甲氨蝶呤对拟南芥种子萌发率和幼苗生长的影响

3．3．1 对种子萌发的影响

3．3．2 对幼苗生长的影响

3．4 不同处理条件下转基因拟南芥的Western blot分析

3．4．1 目的蛋白的纯化

3．4．2 拟南芥在缺硫胁迫条件下目的蛋白表达的分析

3．4．3 不同时间点拟南芥在缺硫胁迫条件下目的蛋白表达分析

3．4．4 拟南芥在不同浓度盐胁迫条件下目的蛋白表达分析

3．4．5 不同时间点拟南芥在盐胁迫条件下目的蛋白表达分析

3．5 转基因拟南芥种子甲硫氨酸含量的测定

4 讨论

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢