谷子NBS类抗病基因的生物信息学分析及在锈菌胁迫中的表达

摘要

核苷酸结合位点(NBS)类型的抗病基因是植物抗病(R)基因中最大的一类。利用抗病基因的同源序列(RGAs)，获得NBS类抗病基因的同源序列，并对其功能进行研究，可为进一步克隆R基因及其介导的抗病分子机制奠定基础。本研究利用生物信息学方法，对谷子2个基因组序列（豫谷1号和张谷）进行分析，从中筛选出含有NBS结构的RGAs，并分析了其数量、类型、系统进化关系等。通过geNorm、Normfinder、Bestkepper3个软件分析了25S rRNA、18S rRNA、17SrRNA、GAPDH、ACTB和UBQ基因表达的稳定性，确定了适于定量分析谷子基因表达的内参基因。利用实时定量PCR(Q-PCR)技术，对其中2个NBS类RGAs在谷子抗锈过程中的表达水平进行分析，为明确NBS类RGAs的功能及其在抗病过程中分子机制奠定基础。本研究获得如下主要结果:
　　 1.利用同源序列比对，从豫谷1号中获得了269个NBS类抗病基因同源序列(RGAs)，从张谷中获得281个NBS类RGAs。将2个谷子品种中所获得的NBS类RGAs进行比较，发现164个基因的序列相似度达90％以上，其中72个基因的序列完全相同。
　　 2.将所获得的NBS类RGAs进行分类，确定了所获得的基因序列可分为6种类型:CC-NBS、CC-NBS-LRR、NBS、NBS-LRR、TIR-NBS和Others。分析发现，CC-NBS-LRR类RGAs的数量最多，TIR-NBS类RGAs数量最少。豫谷1号共有87个CC-NBS-LRR类同源基因，占总数的35％;张谷中有81个CC-NBS-LRR类同源基因，占其总数的29％。豫谷1号仅有2个TIR-NBS类同源基因，张谷中没有TIR-NBS类同源基因。
　　 3.通过对所获得的NBS类RGAs进行物理定位分析，发现位于第8染色体上的基因数量最多（豫谷1号86个，张谷112个），在第9染色体上的基因数量最少（豫谷1号8个，张谷12个）。对来源不同的同一基因所在染色体的位置进行分析，发现大多数基因在染色体上的位置相同，仅有少数基因存在位置颠倒。通过对所获得的NBS类RGAs进行分析发现，豫谷1号中有161个基因是以基因簇形式存在于基因组中的，共形成了34个基因簇;张谷中有151个基因形成了28个基因簇。其中最大的基因簇均位于第8条染色体上，分别含有12、16个基因。
　　 4.利用Q-PCR技术，对谷子ACTB、UBQ、17SrRNA、Gapdh、18S rRNA和25SrRNA基因的表达进行分析，发现25S rRNA在不同品种的叶片中表达水平最为稳定，其次是18S rRNA，因此25S rRNA和18S rRNA可作为基因表达研究的内参基因。研究发现，豫谷1号在接种锈菌后的不同时间时，18S rRNA的表达水平最为稳定;在豫谷1号不同组织中，17SrRNA的表达水平最为稳定。
　　 5.对NBS-1(NBS)、NBS-2(NBS-LRR)基因进行Q-PCR分析，发现NBS-1、NBS-2在抗病品种十里香和感病品种豫谷1号中的表达规律基本一致，均为接菌后表达水平显著下降，随后表达水平逐渐上升;且在抗病品种中的表达水平均明显高于感病品种，初步确定NBS-1、NBS-2为谷子抗锈病相关基因。

目录

声明

摘要

缩写词表

1 引言

1．1 植物抗病基因研究进展

1．1．1 植物抗病基因的结构及分类

1．1．2 植物R基因的克隆

1．2 实时荧光定量PCR

1．2．1 Q-PCR的基本原理

1．2．2 Q-PCR的重要参数

1．2．3 Q-PCR中的标记方法

1．2．4 内参基因

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 谷子基因组DNA信息的获得

2．1．2 试验仪器

2．2 谷子NBS类抗病基因的生物信息学分析

2．2．1 NBS类抗病基因的筛选

2．2．2 MBS类型基因的分类

2．2．3 NBS类型基因的物理定位

2．2．4 NBS类型基因系统进化树的构建

2．3 谷子Q-PCR的内参基因筛选

2．3．1 叶片采集

2．3．2 RNA的提取

2．3．3 cDNA的第一链合成

2．3．4 内参基因表达稳定性的Q-PCR分析

2．3．5 数据处理和分析数据

2．4 NBS-1、NBS-2在锈菌胁迫下的基因表达分析

2．4．1 NBS-1、NBS-2基因的生物信息学分析

2．4．2 基因表达分析

3 结果与分析

3．1 谷子NBS类RGAs的生物信息学分析结果

3．1．1 NBS类候选数据库的建立

3．1．2 NBS类型基因的分类

3．1．3 NBS类的物理图谱

3．1．4 NBS类建树分析

3．2 谷子Q-PCR的内参基因筛选

3．2．1 总RNA的提取

3．2．2 Q-PCR引物分析

3．2．3 Q-PCR中各基因的Ct值

3．2．4 geNorm分析

3．2．5 NormFinder分析

3．2．6 BestKeeper分析

3．2．7 适合Q-PCR的内参基因确定

3．3 NBS-1、NBS-2在锈菌胁迫下的基因表达分析

3．3．1 NBS-1、NBS-2基因的生物信息学分析

3．3．2 NBS-1、NBS-2基因的表达分析

4 讨论

4．1 谷子NBS类RGAs的数量、种类及进化关系研究

4．2 谷子Q-PCR内参基因的筛选

4．3 谷子RGAs在抗病过程中的功能

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢

附录