山羊Agouti基因启动子活动性区探究

摘要

本实验中是在前期拼接获得12847bp的山羊Agou打基因序列(EF587236和JN651404)，和对其进行启动子活性区域预测所确定的候选启动子区为6450-7100bp，并预测7100bp处是山羊Agouti基因的转录起始位点的基础上，对山羊Agouti基因启动子活性区域进行进一步的试验验证。
　　 在转录起始位点上游2kb左右的区域利用PrimerPremier5.0软件设计引物，得到了一个长度为2537bp的DNA片段，其中1283-1935bp为前期启动子预测区域，在该区域中发现了一个典型转录因子结合位点TATA框，一个Oct-1为八碱基区的转录因子结合位点，并预测到HSF、SYR、GATA-1、Nkx-2、ADR1等多个转录因子结合位点;1895-2533bp与人的Agouti基因的启动子有较高的相似性（相似性为75％），预测到GATA-X、GATA-3和GATA-1等转录因子结合位点，GATA基序普遍存在于转录起始部位的上游、启动子或其临近部位。
　　 根据转录因子结合位点的分布情况和引物设计合理性原则，将所得到的2537bp的序列为最长的克隆片段，其他片段利用PrimerPremier5.0软件设计分别设计不同长度的缺失片段，并构建10个荧光素酶报告基因质粒如下:（以片段的起止位置进行质粒的命名）:pGL3-Basic(1-2537)、pGL3-Basic(462-1964)、pGL3-Basic(462-1817)、pGL3-Basic(819-1817)、pGL3-Basic(819-1585)、pGL3-Basic(819-1402)、pGL3-Basie(819-1248)、pGL3-Basic(1846-2537)、pGL3-Basic(1869-1981)、pGL3-Basic(2128-2291)。
　　 用绿色荧光蛋白质粒(GFP)及pGL3-Control质粒和pRL-TK质粒探索得到两种细胞的最佳转染体系:A375细胞脂质体与质粒总量的比例为1∶1，待检测或对照质粒与pRL-TK的比例为100∶1;293T细胞脂质体与质粒总量的比例为1∶1，待检测或对照质粒与pRL-TK的比例为800∶1。
　　 根据所得到的最佳转染体系，分别对A375细胞及293T细胞利用所构建的质粒进行双荧光素酶报告基因的瞬时转染，结果用SPSS17.0软件进行分析，结果表明:A375细胞的转染数值普遍高于293T细胞，即可证明A375细胞的转染效率高于293T细胞;所构建的含有缺失片段的质粒与阴性对照相比不存在显著性差异，说明所获得的2537bp的位于转录起始位点的DNA片段中不含有启动子活性区域。
　　 在后续的山羊Agouti启动子的研究中，我们可以继续以绵羊Agouti基因(EU185099)进行引物设计扩增山羊Agouti基因5'端序列，分析其中存在的不同剪切体，最终确定该基因转录起始位点的位置，再在此基础上进行启动子活性区域的研究。

目录

声明

论文说明

摘要

1 引言

1．1 毛色遗传研究现状

1．2 Agouti基因研究现状

1．2．1 Agouti基因作用机理

1．2．2 Agouti基因研究现状

1．2．3 山羊Agouti基因研究现状

1．2．4 本课题组对山羊Agouti基因研究成果

1．3 启动子的研究方法

1．3．1 真核生物的启动子

1．3．2 启动子的研究方法

1．4 本研究的目的意义及主要内容

1．4．1 研究的目的和意义

1．4．2 研究的主要内容

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株、质粒、载体和细胞

2．1．2 主要试剂及配制

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要分子生物学软件

2．2 方法

2．2．1 山羊DNA的提取

2．2．2 转录因子结合位点分析和引物设计

2．2．3 PCR扩增

2．2．4 PCR产物切胶回收

2．2．5 PCR产物纯化

2．2．6 PCR回收产物与PMD19-T载体连接

2．2．7 大肠杆菌感受态细胞制备

2．2．8 连接产物的转化

2．2．9 重组质粒的快速筛选

2．2．10 质粒的小量提取及酶切鉴定

2．2．11 报告基因载体的构建

2．2．12 质粒的无内毒素大量提取和浓度测定

2．2．13 细胞培养

2．2．14 细胞的转染实验

2．2．15 报告基因的活性分析

2．2．16 数据处理

3 结果与分析

3．1 基因组DNA的提取结果

3．2 山羊Agouti基因启动子预测区域的获得

3．3 重组质粒pMD19-T／2537的鉴定

3．3．1 PCR鉴定

3．3．2 酶切鉴定

3．3．3 测序鉴定

3．4 启动子预测区转录因子结合位点分析

3．5 从重组质粒PMD19-T／2537中获得截短片段

3．6 重组质粒pGL3-Basic／px的鉴定

3．6．1 PCR鉴定

3．6．2 酶切鉴定

3．6．3 测序鉴定

3．7 细胞培养

3．8 细胞转染及检测结果

3．8．1 最佳转染效率的确定

3．8．2 细胞转染检测结果及数据分析

4 讨论

4．1 实验过程讨论

4．1．1 PCR扩增条件掌控

4．1．2 转录因子结合位点分析

4．1．3 重组质粒的构建

4．1．4 影响转染实验的因素

4．1．5 细胞转染的最佳体系

4．2 实验结果讨论

5 结论

参考文献

在读期间发表论文情况

作者简历

致谢