粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)Ha1菌株及其代谢产物除草活性研究

摘要

本研究从479株海洋微生物中分离纯化得到1株除草活性较强的Ha1菌株，生物活性测定发现，其粗提物对马唐的和莱茵衣藻（单位体积细胞个数、细胞干重和叶绿素含量）具有较强的活性;利用硅胶柱层析法和高效液相色谱法(HPLC)对其粗提物中的除草活性物质进行了分离纯化;研制出了Ha1菌株活体颗粒剂，并测定了其除草活性。主要研究结果如下:
　　1.对479株细菌菌株分别编号，即Ha1、Ha2、Ha3、……Ha479，经生物测定从中筛选得到4株除草活性较高的菌株，分别为Ha1、Ha17、Ha38和Ha384，其中菌株Ha1的除草活性最强。
　　2.通过16S rDNA序列分析、结合生理生化试验结果，将Ha1菌株鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）。Ha1菌株为革兰氏阴性菌，糖醇发酵和水解淀粉试验为阴性反应，吲哚试验、VP试验、MR试验、硫化氢试验和过氧化氢酶接触试验均为阳性反应，Ha1菌株为葡萄糖氧化发酵型菌;将得到的Ha1菌株的16S rDNA保守序列在NCBI网站上进行blast同源性比对，绘制系统发育树，发现该菌株与数十株沙雷氏菌株有同源性，其中与粘质沙雷氏菌Serratia marcescens WW4相似度达100％。
　　3.粘质沙雷氏菌Ha1菌株的代谢产物对马唐的生长、种子萌发和莱茵衣藻的生长均有一定的抑制作用。对马唐种子萌发的根长和芽长的IC50分别为2828 mg·L-1和3332 mg·L-1;对莱茵衣藻的IC50为628 mg·L-1，在单位体积的藻细胞个数和干重上，粗提物浓度在0～0.5 mg·mL-1对莱茵衣藻的毒性效应表现为明显的刺激作用，当粗提物浓度大于0.5 mg·mL-1时，对莱茵衣藻的生长表现为抑制作用，并且随着粗提物的浓度增大，抑制作用增强;而在叶绿素含量指标上，表现的抑制作用则是剂量依赖型的。
　　4.采用硅胶柱层析法对粗提物进行了分离，并用HPLC跟踪检测活性组分进行纯化，流动相为甲醇-水(7∶3，v/v)，流速1 mL·min-1，进样量10μL，柱温25℃，波长257 nm。根据生测和HPLC检测结果，合并相同组分，最后获得8个组分，其中组分3、组分4显示出较好的除草效果。利用HPLC对组分3、组分4进行分离纯化，流动相为甲醇-水(6∶4，v/v)，流速1 mL·min-1，进样量20μL，柱温25℃，波长214nm，从组分4中分离纯化得到物质Ⅰ为其有效除草活性物质。
　　5.对Ha1菌株活体制剂进行了研制，制成了粗面粉-高岭土活体颗粒剂，并测定了贮存温度和添加助剂玉米油对颗粒剂中活菌数和除草活性的影响。结果显示，4℃贮存和添加助剂玉米油均能保存颗粒剂中活菌的存活率和增强颗粒剂的除草活性。贮存8周后，4℃贮存的和室温（25±2）℃贮存的活菌数分别减少4.3和5.5个单位;4℃贮存的颗粒剂对马唐的抑制活性高于室温贮存，4℃贮存的颗粒剂对马唐的抑制率由起初的83％下降至23％，室温贮存的颗粒剂对马唐的抑制率由起初的70％下降至17％。贮存8周后，4℃贮存条件下添加助剂的粘质沙雷氏菌Ha1颗粒剂中的活菌数分别减少了3.55和4.95个单位;添加助剂的颗粒剂对马唐的抑制活性总是高于未添加助剂的，添加助剂的颗粒剂对马唐的抑制率由起初的90％下降至50％，而未加助剂的颗粒剂对马唐的抑制率由起初的83％下降至23％。

目录

声明

摘要

缩写词表

1 引言

1．1 杂草的危害与防治现状

1．2 微生物除草剂的开发与应用现状

1．3 海洋微生物在农业方面的研究进展

1．4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 菌株来源和供试植物

2．2 试剂

2．3 培养基

2．4 仪器

2．5 菌株的分离筛选及粗提物的除草活性测定

2．5．1 西瓜果腐病源菌株的分离纯化

2．5．2 海洋菌株的分离纯化

2．5．3 菌株粗提物的制备

2．5．4 粗提物活性测定

2．6 活性菌株的鉴定

2．6．1 生理生化鉴定

2．6．2 16S rDNA分子鉴定

2．7 Ha1菌株粗提物除草活性评价

2．7．1 种子荫发法测定抑制中浓度(IC50)

2．7．2 Ha1菌株粗提物对莱茵衣藻的毒性测定

2．8 Ha1菌株颗粒剂的研制及活性测定

2．8．1 颗粒剂的制备

2．8．2 实验室内评估粘质沙雷氏菌Ha1颗粒剂的除草活性

2．8．3 温度对粘质沙雷氏菌Ha1颗粒剂中活菌数和马唐的抑制活性影响

2．8．4 4℃贮存添加助剂对粘质沙雷氏菌Ha1颗粒剂中活菌数和马唐的抑制活性影响

2．9 Ha1菌株粗提物中除草活性物质的分离纯化

2．9．1 菌体蛋白的提取

2．9．2 粗提物的分离纯化

2．10 数据统计分析

3 结果与分析

3．1 除草活性菌株的分离筛选

3．2 除草活性菌株的鉴定

3．2．1 Ha1菌株的生理生化结果

3．2．2 活性菌株的16S rDNA分子鉴定

3．3 粘质沙雷氏菌Ha1菌株粗提物除草活性评价

3．3．1 种子萌发法测定Ha1菌株粗提物对马唐抑制中浓度IC50

3．3．2 Ha1菌株粗提物对莱茵衣藻的毒性效应

3．4 粘质沙雷氏菌Ha1菌株颗粒剂的研制及除草活性评价

3．4．1 实验室内Ha1菌株颗粒剂除草活性评价

3．4．2 贮存温度对Ha1菌株颗粒剂中活菌数和马唐的抑制活性

3．4．3 4℃贮存添加助剂对颗粒剂中活菌数和马唐抑制活性的影响

3．5 粘质沙雷氏菌Ha1菌株粗提物中除草活性物质的分离纯化

3．5．1 Ha1菌株菌体蛋白对马唐的生物活性

3．5．2 Ha1菌株粗提物的分离纯化

4 讨论

4．1 除草活性菌株是生物源除草剂的主要来源

4．2 活体制剂已经成为微生物源除草剂的研发热点

4．3 微生物的次生代谢产物可以提供结构新颖的除草活性物质和先导化合物

5 结论

参考文献

发表论文

作者简历

致谢