黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺抗性风险及抗性机制的研究

摘要

由古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)引起的黄瓜霜霉病是黄瓜生产上的一种毁灭性病害，流行性强，传播速度快，可造成黄瓜大幅减产。目前生产上主要依靠化学药剂进行防治。双炔酰菌胺(mandipropamid)是羧酸酰胺类(CAA)杀菌剂中的一种新型药剂，对卵菌病害（黄瓜霜霉病、葡萄霜霉病、马铃薯晚疫病等）具有较好的防治效果。至今未见黄瓜霜霉病菌对该药抗性风险的研究报道，本研究为探明黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的抗性风险及抗性机制，测定了黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的敏感性，建立了其对双炔酰菌胺的敏感基线，评估了其对双炔酰菌胺的室内抗性风险，并结合分子生物学的方法研究了该病原菌对双炔酰菌胺的抗性机制。主要研究结果如下:
　　1、采用叶盘漂浮法测定了从河北、山东等未使用过CAA类杀菌剂的地区采集的69株黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的敏感性(EC50)，其EC50范围为0.096～0.695μg/mL之间，平均值为0.358±0.144μg/mL，不同敏感性菌株所占频率呈连续单峰曲线分布，未发现敏感性下降的亚群体，因此可将这69个野生敏感菌株对双炔酰菌胺的敏感性平均值0.358±0.144μg/mL作为黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的敏感基线。
　　2、采用叶盘漂浮法测定2011-2013年自河北、山东等地采集的黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的敏感性，总体分析3年所采集的菌株对双炔酰菌胺以敏感菌株为主，有部分低抗和中抗菌株，没有发现高抗菌株;通过3年来黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的敏感性监测，发现其对双炔酰菌胺的敏感性变化不大，抗性菌株的比例无明显增大。
　　3、采用药剂驯化和紫外诱导的方法分别处理黄瓜霜霉病菌11个对双炔酰菌胺的敏感菌株。药剂驯化未获得抗性菌株，紫外诱导获得6株抗双炔酰菌胺突变体，其抗性突变频率为1.09×10-7，EC50值介于0.439～1.910μg/mL之间，抗性水平介于5.74～22.96倍之间。通过紫外诱导获得的6株抗双炔酰菌胺突变体的侵染率、致病性、产孢能力和适合度指数均显著低于其亲本菌株，且抗药性不能稳定遗传。交互抗性试验表明，双炔酰菌胺与甲霜灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟吡菌胺之间无交互抗性关系，与烯酰吗啉之间有正交互抗性关系。
　　4、采用CTAB法提取所测黄瓜霜霉菌株的DNA，测序后利用DNAMAN分析软件进行序列比对，发现只有亲本菌株KB-1经紫外诱导后获得的突变体KB-1-9UV在纤维合酶3(CesA3)基因编码的氨基酸序列的940位发生突变，使该位点氨基酸由缬氨酸（GTT编码）变为丙氨酸（GCT编码）(V940A)，其他突变体以及田间采集到的中抗菌株的CesA3基因序列均未发生碱基突变;突变体KB-1-9UV继代培养10代后，敏感性下降，抗性基本消失，收集其孢子囊提取DNA测序后发现，KB-1-9UV抗性消失后其基因序列与亲本菌株相同，突变恢复，此位点的突变不稳定。
　　5、根据早期检测的黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的敏感性表现、实验室条件下获得的抗双炔酰菌胺突变体的生物学特性以及黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺抗性机制的研究结果，推测黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺存在低到中等抗性风险。

目录

声明

摘要

引言

1 黄瓜霜霉病

2 黄瓜霜霉病防治

2．1 化学防治

2．2 农业防治

2．3 选育抗病品种

2．4 生物防治

3 黄瓜霜霉病菌抗性的研究

4 羧酸酰胺类(CAA类)杀菌剂开发及研究现状

4．1 羧酸酰胺类杀菌剂的研发历程及分类

4．2 羧酸酰胺类杀菌剂的生物活性及作用机制

4．3 病原菌对羧酸酰胺类杀菌剂的抗性

4．4 病原菌对羧酸酰胺类杀菌剂的抗性机制

5 病原菌的抗性治理策略

6 现代分子生物学技术在病原菌抗性方面的应用

7 研究目的及意义

第一章 黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的抗性风险研究

1 试验材料

1．1 试验药剂

1．2 供试作物

1．3 供试菌株

2 试验方法

2．1 药液的配制

2．2 黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺敏感基线的建立

2．3 黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的抗性检测

2．4 黄瓜霜霉病菌抗双炔酰菌胺突变体的获得

2．5 抗性突变体对双炔酰菌胺抗性水平的测定

2．6 抗性突变体的适合度测定

2．7 抗性突变体遗传稳定性的测定

2．8 双炔酰菌胺与不同杀菌剂之间的交互抗性关系研究

2．9 数据分析

3 结果与分析

3．1 黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺敏感性基线的建立

3．2 黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的抗性检测

3．3 黄瓜霜霉病菌抗双炔酰菌胺突变体的获得及抗性水平

3．4 黄瓜霜霉病菌抗双炔酰菌胺突变体的适合度

3．5 黄瓜霜霉病菌抗双炔酰菌胺突变体的遗传稳定性

3．6 双炔酰菌胺与其他杀菌剂之间的交互抗性关系

4 讨论

第二章 黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺抗性机制的研究

1 试验材料

1．1 供试菌株

1．2 菌株培养

1．3 供试作物

1．4 供试试剂

1．5 试验仪器

2 试验方法

2．1 试剂的配制

2．2 DNA的提取

2．3 PCR扩增

2．4 目的片段的纯化回收

2．5 目的片段的连接(DNA重组)

2．6 重组质粒转化大肠杆菌

2．7 转化子的筛选

2．8 菌液PCR

2．9 送样测序及分析

3 结果分析

4 讨论

第三章 全文总结

参考文献

在读期间发表论文

作者简介

致谢