小麦ATG8基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能研究

摘要

自噬是广泛存在于真核细胞中对损伤的细胞器和长寿命蛋白进行降解的一条途径，在饥饿、氧化胁迫、干旱、盐、病原菌侵染等逆境条件或细胞分化、细胞死亡和衰老等过程中，对于维持细胞代谢平衡及正常生长发育和环境适应等有十分重要的作用。本实验室前期工作初步证明小麦自噬降解途径的两个核心蛋白ATG6和ATG8参与了小麦抵抗叶锈菌侵染过程。在此基础上，本试验以拟南芥野生型和atg8突变体为材料，通过构建真核表达载体，运用农杆菌浸花法转化拟南芥获得超表达TaATG8的阳性纯合体植株，进一步通过非生物胁迫（干旱、盐、ABA、营养匮乏）与生物胁迫（白粉菌侵染）试验揭示小麦ATG8在植物抵抗逆境中的作用;通过对生物量的统计阐明小麦ATG8在植物生长发育中的作用。获得的主要结果如下:
　　1、从小麦幼苗叶片中克隆得到了TaA TG8基因的全长。
　　2、通过生物信息学分析，AtATG8与TaA TG8氨基酸序列有很高的同源性，相似度达84.03％，且通过黑暗处理拟南芥后用MDC标记自噬体得知转TaATG8拟南芥恢复了AtATG8的功能，且在黑暗诱发的叶片衰老过程中AtATG8和TaATG8均参与了自噬体的形成，表明AtATG8与TaATG8功能高度保守。
　　3、构建了pSuper1300+-TaATG8的超表达载体，通过农杆菌花序浸染法转化拟南芥获得超表达TaATG8基因的阳性纯合体植株。
　　4、通过分子验证获得拟南芥ATG8基因敲除突变纯合体，并对该突变体进行农杆菌转化，获得TaATG8回复突变阳性纯合体植株。
　　5、通过生物量统计，过表达TaATG8基因使拟南芥果荚数和种子数均增加，TaATG8可能是产量相关基因。
　　6、通过盐、干旱、营养匮乏等非生物逆境处理，ATG8基因可能与拟南芥响应缺蔗糖、盐、干旱、ABA和氧化胁迫有关，在这几种逆境胁迫下对种子的萌发率影响较大;TaATG8和AtATG8基因在拟南芥幼苗期抵抗各种非生物胁迫中发挥了很重要的作用;ATG8基因参与了成苗期对干旱胁迫与营养胁迫的响应。
　　7、通过白粉菌侵染拟南芥试验，证实TaATG8基因在拟南芥抵抗白粉菌侵染过程中发挥正调控作用。

目录

声明

摘要

英文缩写表

1 引言

2 材料与方法

2．1 主要仪器、试剂与供试材料

2．1．1 试验仪器

2．1．2 供试试剂

2．1．3 试验材料

2．1．4 试验涉及的培养基及营养液配方

2．1．5 试验涉及的药物配置

2．1．6 供试小麦幼苗的培养、接种和取样

2．1．7 供试拟南芥的培养

2．2 拟南芥Atatg8突变体纯合植株的鉴定

2．3 TaATG8基因的PCR扩增与表达载体构建

2．4 过表达TaATG8基因的拟南芥与回复突变阳性植株的获得

2．4．1 农杆菌介导的拟南芥转化

2．4．2 转基因种子的收获以及转基因苗的筛选与鉴定

2．5 黑暗处理

2．6 非生物胁迫方面的表型分析

2．6．1 逆境处理下种子萌发率分析

2．6．2 逆境处理下幼苗阶段生理表型试验

2．6．3 高盐处理下成苗阶段生理表型试验

2．6．4 干旱处理下成苗阶段生理表型试验

2．6．5 缺磷处理下成苗阶段生理表型试验

2．7 接种白粉菌后的表型分析试验

2．8 ATG8对拟南芥结种量影响的分析

3 结果与分析

3．1 拟南芥atg8突变体纯合植株的鉴定

3．2 TaATG8基因的PCR扩增与表达载体的构建

3．2．1 总RNA完整性鉴定和RNA浓度及纯度测定

3．2．2 TaATG8基因的PCR扩增

3．2．3 TaATG8基因与克隆载体连接

3．2．4 pSuper1300+-TaATG8载体的构建

3．2．5 pSuper1300+-TaATG8载体的农杆菌转化

3．3 拟南芥的农杆菌转化及阳性植株的筛选和鉴定

3．4 黑暗处理下不同基因型拟南芥叶片经MDC标记的结果

3．5 非生物逆境条件下表型比较分析

3．5．1 不同逆境处理下4种基因型拟南芥种子萌发率比较分析

3．5．2 逆境处理下幼苗阶段生理表型试验

3．5．3 逆境处理下成苗阶段生理表型试验

3．6 接种白粉菌后的表型观察

3．7 ATG8对结种量的影响

4 讨论

4．1 开展TaATG8功能研究的意义

4．2 构建TaATG8超表达载体的意义

4．3 自噬在植物抵抗非生物逆境胁迫中的作用

4．4 自噬在拟南芥抵抗白粉菌侵染过程中的作用

4．5 ATG8基因在植物生长发育中的作用

4．6 对TaATG8基因功能研究的展望

5．结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢