BR调控蛋白PMRP与拟南芥耐逆性的关系

摘要

植物在自然界中经常会遇到环境条件的剧烈变化，其幅度若超过了植物正常生命活动的范围时，植物就会受到伤害，甚至死亡。因此提高植物的抗逆性对提高作物产量具有十分重要的意义。油菜素内酯(Brassinosteroids，BRs)是迄今为止国际上公认的高效、广谱、无毒的植物生长激素。BRs可以改善植物的生理代谢，提高植物抵抗逆境的能力，因此明确BRs提高植物耐逆性的机理，对其在农业生产中经济、有效的利用具有指导意义。
　　参与逆境调控的BR调控蛋白的功能及作用机制分析是揭示BR提高植物抗逆性的基础。PMRP(Putative membrane-related protein，AT3G13062)是一个推测的受BR调控的膜蛋白，很可能在植物逆境调控中起着重要的作用。本研究对PMRP在逆境调控中的功能及作用机制进行了分析，获得以下主要结果:
　　1.PMRP由411个氨基酸组成，含有START(the lipid/sterol-binding StAR-relatedlipid transfer protein domains)保守结构域，具有参与脂类运输和代谢的功能;PMRP含有磷脂酰胆碱结合位点，推测PMRP可能会参与植物的逆境调控过程。
　　2.通过对PMRP功能获得和缺失的转基因拟南芥对干旱胁迫、盐胁迫和冷胁迫的响应，分析了PMRP在拟南芥逆境调控中的作用。
　　(1)PMRP在拟南芥耐旱过程中发挥了作用。把Col-0野生型拟南芥和PMRP转基因拟南芥株系的种子种在含300 mmol·L-1甘露醇的1/2MS培养基上，培养10d后发现，在含有300 mmol·L-1甘露醇的1/2MS培养基上，野生型拟南芥绿叶率为62.2％，而3个过表达PMRP转基因拟南芥株系的绿叶率则分别为35.6％、31.8％、25.2％，3个PMRP-RNAi转基因拟南芥株系的绿叶率分别为62.8％、60.7％、61.4％，表明，PMRP表达量的升高降低了拟南芥的耐早性，而PMRP表达量的降低对拟南芥的耐早性无显著影响。
　　(2)PMRP在拟南芥耐盐过程中发挥了作用。把Col-0野生型拟南芥和PMRP转基因拟南芥株系的种子种在含有150 mmol·L-1 NaCl的1/2MS培养基上，培养10d后发现，在含有150 mmol·L-1 NaCl的1/2MS培养基上，野生型拟南芥的绿叶率为64.6％，3个过表达PMRP转基因拟南芥株系的绿叶率分别为10.6％、19.7％和18.2％，3个PMRP-RNAi转基因拟南芥株系绿叶率分别为56.8％、63.7％、57.6％，表明，PMRP表达量的升高也降低了拟南芥的耐盐性，同样，PMRP表达量的降低对拟南芥的耐盐性无显著影响。
　　(3)PMRP在拟南芥耐冷过程中发挥了作用。选取16h光照、21℃条件下培养的21d的野生型拟南芥、3个过表达PMRP转基因拟南芥株系和3个PMRP-RNAi转基因拟南芥株系，用冷光源培养箱培养，先在4℃下培养7d，然后在-8℃下培养1.5 h，取出放到16h光照、21℃条件下培养7d后，野生型拟南芥的绿叶率为48％，过表达PMRP转基因拟南芥的绿叶率分别为48.6％、47.8％、49.2％，3个PMRP-RNAi转基因拟南芥的绿叶率分别为65.9％、67.4％、68.3％，表明，PMRP表达量的降低增强了拟南芥的耐冷性。
　　3.PMRP参与拟南芥逆境调控的作用机制分析。在逆境胁迫下，细胞膜的透性及光合作用是胁迫反映的生理指标，冷胁迫下能够影响叶绿体的结构，因此我们对PMRP功能获得和缺失的转基因拟南芥进行了细胞膜透性和光合速率的测定及叶绿体超微结构的观察。
　　(1)PMRP对细胞膜稳定性的影响。选取14d的野生型拟南芥、3个过表达PMRP转基因拟南芥株系和3个PMRP-RNAi转基因拟南芥株系，对其莲座叶细胞渗出液电导率进行测定。结果表明，用150 mmol·L-1NaCl处理4h后，野生型拟南芥莲座叶的渗出液电导率为70.7μS·cm-1，过表达MRP转基因拟南芥莲座叶的渗出液电导率分别为83.8、96.17和85.1μS·cm-1，可见，PMRP表达量的升高加剧了盐胁迫对细胞膜的损伤。在-8℃下处理30 min，野生型拟南芥莲座叶的渗出液电导率为70.67μS·cm-1，3个PMRP-RNAi拟南芥株系莲座叶渗出液电导率分别为48.57、45.40和52.10μS·cm-1。表明，PMRP表达量的降低明显降低了逆境对细胞膜的损伤。
　　(2)PMRP对拟南芥光合速率的影响。选取在16h光照、21℃条件下培养，生长14 d的野生型拟南芥和3个PMRP-RNAi转基因株系，分别测定莲座叶的光合速率，结果表明，野生型拟南芥的光合速率为7.3 umol/m2·s，3个PMRP-RNAi转基因拟南芥株系的光合速率分别为8.8、7.8和8.5 umol/m2·s，说明，PMRP表达量的降低略增强了拟南芥的光合速率。
　　(3)PMRP对拟南芥叶绿体超微结构及淀粉粒积累的影响。选取在16h光照、21℃条件下培养的PMRP-RNAi转基因拟南芥和野生型拟南芥完全展开的莲座叶，对其超微结构进行观察。结果表明，野生型拟南芥莲座叶细胞中，叶绿体为椭圆形，而PMRP-RNAi转基因拟南芥莲座叶细胞叶绿体变为近似圆形;在光照情况下，PMRP-RNAi转基因拟南芥叶绿体中淀粉粒的积累与野生型相似，均有明显的淀粉粒积累，但在黑暗环境中，PMRP-RNAi转基因拟南芥叶绿体中淀粉粒积累明显增多。

目录

声明

摘要

缩写词表

1 引言

1．1 油菜素内酯(BRs)与盐胁迫

1．2 油菜素内酯(BRs)与干旱胁迫

1．3 油菜素内酯(BR)与冷胁迫

1．4 PMRP结构解析及其与抗逆性的关系

1．5 非生物胁迫对植物叶绿体的影响

1．6 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 供试拟南芥、载体及菌株

2．1．2 供试试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 供试培养基、营养液、溶液、染色液

2．1．5 引物设计软件

2．2 试验方法

2．2．1 拟南芥的种植与培养

2．2．2 拟南芥幼苗总RNA的提取及反转录

2．2．3 PMRP的生物信息学分析

2．2．4 PMRP-RNAi载体的构建

2．2．5 大肠杆菌感受态的制备及转化

2．2．6 质粒提取

2．2．7 农杆菌感受态GV3101的制备与转化

2．2．8 转基因拟南芥的获得

2．2．9 转基因拟南芥的验证

2．2．10 干旱胁迫对转基因拟南芥的分析

2．2．11 盐胁迫对转基因拟南芥的分析

2．2．12 冷胁迫对转基因拟南芥的分析

2．2．13 转基因拟南芥叶片细胞膜透性的测定

2．2．14 拟南芥电镜超微结构的观察

3 结果与分析

3．1 PMRP蛋白的功能域及结合位点

3．1．1 PMRP蛋白的功能域分析

3．1．2 PMRP蛋白的结合位点分析

3．2 PMRP在拟南芥耐逆性中的作用分析

3．2．1 PMRP-RNAi转基因拟南芥的获得

3．2．2 PMRP在拟南芥干旱胁迫中的作用

3．2．3 PMRP在拟南芥盐胁迫中的作用

3．2．4 PMRP在拟南芥冷胁迫中的作用

3．3 PMRP调控拟南芥耐逆性的作用机制

3．3．1 PMRP对拟南芥细胞膜稳定性的影响

3．3．2 PMRP对拟南芥光合速率的影响

3．3．3 PMRP对拟南芥叶绿体结构的影响

3．3．4 PMRP对拟南芥叶绿体内淀粉粒积累的影响

4 讨论

4．1 PMRP在逆境中的作用

4．2 PMRP在低温胁迫下的作用机制

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢