水杨酸在小麦抵抗叶锈菌侵染中的作用初探

摘要

小麦叶锈菌属于专化性非常强的活体寄生真菌，在不亲和组合中寄主通过产生过敏性反应(hypersensitive response，HR)的方式来抵抗叶锈菌(Pucciniatriticina)的侵染。水杨酸(salicylic acid, SA)已被证实涉及并参与多种植物（如烟草、黄瓜和拟南芥）的HR和系统获得抗性(systemic acquired resistance，SAR)反应。有研究发现，大麦中依赖于SA的氧化信号增强机制能够将信号传递到细胞核，促使感病部位产生HR，从而阻止致病因子的扩散。大量研究表明，EDS1(enhanceddisease susceptibility1)不仅是基础抗性的重要调控因子，也是TIR-NB-LRR类R蛋白防御体系中HR发生的关键元件，可促进SA积累，增加的SA又会反馈使EDS1和PAD4(phytoalexin deficient4)上调，从而形成一个起信号放大作用的回路。本研究在实验室前期工作的基础上，利用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术沉默TaEDS1基因，研究对不亲合组合寄主HR发生的影响。同时利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)技术测定小麦受叶锈菌侵染过程中SA含量的变化、利用实时定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)技术检测SA合成途径中的两个关键基因TaICS(isochorismate synthase1)及TaPAL(phenylalanine ammonia lyase)的表达趋势。在此基础上利用RNAi技术获得TaICS沉默植株，初步探讨SA在小麦抵抗叶锈菌侵染的防卫反应发生中的作用。本研究对进一步探讨在寄主产生HR过程中TaEDS1和SA之间的关系，找到小麦抗叶锈HR发生的重要组分，完善诱发机理具有重要意义。
　　本研究主要获得以下试验结果:
　　1、在互作早期即接种后8h，不亲和组合中游离及结合态SA的含量比接种后0h显著增加，而模拟接种及亲和组合在接种后不同时间点SA的含量变化并不明显。由此初步证明SA参与小麦抵抗叶锈菌侵染的过程。
　　2、实时定量PCR检测表明，在互作早期（接种后8h），不亲和组合中TaICS和TaPAL基因的表达均高于0h。而亲和组合中，TaICS的表达在接种后不同时间点没有表现增加，TaPAL基因在接种后8h表达水平也增高，但低于不亲和组合。推测TaICS基因在控制SA合成中居于主导地位。
　　3、分别构建了小麦TaEDS1基因和TaICS基因的RNAi植物双元表达载体，并利用农杆菌介导的遗传转化技术将载体转化到小麦愈伤组织中，最终获得RNAiTaEDS1和RNAiTaICS的PCR阳性植株。其中TaEDS1-R2 line4获得T1代Southern检测阳性植株。半定量PCR显示该株系TaEDS1表达被沉默。
　　4、利用TaEDS1-R2 line4T1植株接种叶锈菌小种260，结果显示沉默EDS1后可明显减小单侵染点HR面积，吸气母细胞的数量并无明显变化，说明TaEDS1参与了HR的发生。

目录

声明

摘要

英文缩写表

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验仪器及试验耗材

2．1．1 试验仪器设备

2．1．2 试验试剂耗材

2．2 试验材料

2．2．1 植物材料

2．2．2 供试菌株

2．2．3 载体

2．3 培养基及药品配制

2．3．1 培养基配制

2．3．2 试验药品配制

2．4 水杨酸含量的测定

2．4．1 植物材料采集

2．4．2 水杨酸提取

2．4．3 HPLC测定水杨酸含量

2．5 实时定量检测基因相对表达水平

2．5．1 植物材料采集

2．5．2 RNA提取、纯化及cDNA合成

2．5．3 实时定量引物设计

2．5．4 实时定量PCR

2．5．5 数据处理及分析

2．6 RNAi载体构建

2．6．1 引物设计

2．6．2 载体构建流程

2．7 农杆菌介导的遗传转化

2．7．1 小麦愈伤组织的制备

2．7．2 农杆菌侵染

2．7．3 转基因植株的获得

2．8 遗传转化阳性植株的鉴定

2．8．1 转化植株中报告基因的PCR检测

2．8．2 Southern blot检测抗性基因

2．8．3 转录水平检测基因的沉默效率

2．9 叶锈菌侵染TaEDS1 RNAi阳性植株的细胞学观察

2．9．1 植物材料采集

2．9．2 HR的染色

2．9．3 观察

3 结果与分析

3．1 小麦与叶锈菌互作过程中水杨酸含量的变化

3．2 RT-qPCR检测TaICS和TaPAL基因的相对表达水平

3．3 TaEDS1和TaICS RNAi载体的构建

3．3．1 目的片段的扩增

3．3．2 双酶切验证TaEDS1和TaICS RNAi载体

3．4 转基因阳性植株的鉴定

3．4．1 农杆菌介导的遗传转化

3．4．2 PCR检测阳性植株

3．4．3 PCR阳性植株的Southern-blotting验证

3．4．4 沉默基因转录水平检测

3．5 沉默TaEDS1对不亲和组合的HR面积及菌发育的影响

4 讨论

4．1 在单子叶植物抗病过程中EDS1的作用

4．2 SA在小麦抵抗叶锈菌侵染中的作用

4．3 展望

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢