重组腺病毒介导shRNA干扰绵羊成肌细胞MSTN基因表达及对相关基因的影响

摘要

肌肉的生长是肉羊生产中的重要经济性状，肌肉生成具有十分复杂的机理。肌肉生长抑制素基因Myostatin(MSTN)，是肌肉生长发育的负调控因子。阻断或抑制MSTN基因的功能，可以促进肌肉的生长发育。利用载体介导MSTN沉默，研究MSTN发挥作用的重要位点及通路，为肉用家畜肉质性状育种奠定理论基础。
　　本研究以绵羊成肌细胞为材料，利用RNAi技术沉默MSTN基因，研究干扰前后成肌细胞的增殖和分化情况，初步研究MSTN基因对成肌细胞生长和分化相关基因表达的作用。在此研究基础上建立成肌细胞干扰前后的cDNA文库，应用Illumina MiSeq测序技术对其进行高通量测序，利用生物信息学软件从测序评估、差异基因GO功能注释、Pathway显著性富集等方面进行分析，筛选MSTN调控肌肉生长的关键基因以及信号通路。本研究的主要结果如下:
　　1.建立了绵羊成肌细胞体外分离纯化、培养方法，通过形态学和免疫荧光方法以及利用RT-PCR鉴定成肌细胞的定型因子Myf5和MyoD对成肌细胞进行了鉴定，获得了高纯度的成肌细胞系。
　　2.成功构建4条靶向MSTN编码序列的单元干扰质粒载体以及2条双元干扰质粒载体。利用脂质体lipo3000瞬时转染成肌细胞，转染48h后利用qRT-PCR检测MSTN基因表达量的变化，结果显示质粒载体ShR511以及ShR3+4有干扰效果。
　　3.成功构建了干扰MSTN的腺病毒载体Sh511，Sh3+4，对成肌细胞的感染效率达到90％以上。经qRT-PCR检测Sh511，Sh3+4干扰效率相对于空白对照分别达到了53.40％和75.59％，western blot检测对蛋白的抑制效率分别达到55.27％和64.32％，双元载体干扰效果更明显。MSTN基因被干扰之后，伴随着MyoD，MyoG，My f5，Myf6，leptin基因的极显著性下调(P＜0.01)，引起了IFNGR1基因的极显著升高(P＜0.01)，未引起OAS1基因的显著变化。研究了Sh3+4干扰载体对成肌细胞增殖及分化的影响，发现感染腺病毒干扰载体后成肌细胞的增殖受到了影响，细胞周期停滞在G0/G1期，并且细胞周期抑制因子p21的表达呈上升趋势。在对成肌细胞分化作用的研究中，发现诱导72h时MyoD和MyoG基因的表达在Sh3+4干扰组中显著高于阴性对照组，同时干扰组成肌细胞融合率显著高于对照组，表明抑制MSTN基因对成肌细胞的分化融合起到了促进作用。并且证实了HACD1基因与成肌细胞融合相关。
　　4.本研究基于RNA-seq高通量测序技术，每个样本均得到4G以上表达谱数据，基于FPKM值通过TopHat软件筛选出差异2倍以上的基因，Sh3+4干扰组与阴性对照组相比，上调基因有28个，下调基因有323个;Sh3+4干扰组与空白对照组相比，上调基因有1849个，下调基因有3227个。对差异基因进行GO分类和KEGG pathway富集分析，在Sh3+4干扰组和阴性对照组之间富集到了25条GO条目。发现1组显著富集的pathway，参与了FoxO信号通路。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．1 我国肉羊生产现状

1．2 我国肉羊育种现状及发展趋势

1．2．1 我国肉羊育种现状

1．2．2 我国肉羊育种发展趋势

1．3 骨骼肌的生长发育

1．4 骨骼肌发育相关基因MSTN的研究进展

1．4．2 MSTN基因的结构

1．4．4 MSTN基因的功能

1．4．5 MSTN基因的信号通路

1．5 阻断MSTN基因功能

1．5．1 基因突变

1．5．2 MSTN拮抗蛋白

1．5．3 MSTN—RNAi

1．6 腺病毒载体研究现状

1．6．1 腺病毒的结构

1．6．2 腺病毒载体的发展

1．6．3 腺病毒载体的构建策略

1．6．4 腺病毒载体的优点

1．6．5 腺病毒载体在绵羊上的应用

1．7 转录组测序(RNA—seq)

1．7．1 测序技术发展历程

1．7．2 转录组测序

1．8 本研究的目的和意义

2 绵羊成肌细胞的原代分离纯化培养及鉴定

2．1 试验材料

2．1．1 试验材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 溶液及培养基配制

2．2 试验方法

2．2．1 成肌细胞的分离

2．2．2 成肌细胞的纯化及培养

2．2．3 成肌细胞免疫荧光的鉴定

2．2．4 成肌细胞的RT-PCR鉴定

2．2．5 成肌细胞培养

2．2．6 成肌细胞生长曲线的测定

2．2．7 成肌细胞诱导分化

2．3 结果与分析

2．3．1 成肌细胞的生物学特性观察

2．3．2 成肌细胞的鉴定

2．3．3 成肌细胞的生长曲线

2．3．4 成肌细胞的诱导

2．4 讨论

2．4．1 成肌细胞分离纯化方法

2．4．2 成肌细胞鉴定方法

2．4．3 成肌细胞诱导分化

2．4．4 成肌细胞培养

2．5 小结

3 靶向绵羊成肌细胞MSTN基因的shRNA质粒载体的构建及效果验证

3．1 试验材料

3．1．1 菌株和质粒载体

3．1．2 工具酶和主要试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 溶液及培养基配制

3．1．5 主要分子生物学及数据分析软件

3．2 试验方法

3．2．1 单元MSTN—shRNAs质粒载体构建

3．2．2 双元干扰载体的构建

3．2．3 成肌细胞的培养

3．2．4 不同脂质体介导重组质粒转染成肌细胞

3．2．5 不同脂质体介导转染效率测定

3．2．6 通过qRT-PCR方法检测干扰载体对靶基因的干扰效果

3．3 结果与分析

3．3．1 单元MSTN—shRNAs重组质粒的鉴定结果

3．3．2 双元MSTN—shRNAs重组质粒的鉴定结果

3．3．3 质粒转染成肌细胞结果

3．3．4 干扰效率的验证

3．4 讨论

3．4．1 干扰质粒构建

3．4．2 不同脂质体转染效率检测

3．4．3 干扰效果验证

3．5 小结

4 重组腺病毒介导shRNA干扰绵羊成肌细胞MSTN基因表达及对相关基因的影响

4．1 试验材料

4．1．1 细胞和质粒载体

4．1．2 工具酶和主要试剂

4．1．3 主要仪器设备

4．2 试验方法

4．2．1 shRNA重组腺病毒的构建

4．2．2 腺病毒感染预实验

4．2．3 腺病毒干扰载体对MSTN基因及其相关基因的影响

4．2．4 腺病毒干扰载体对成肌细胞增殖的影响

4．2．5 成肌细胞分化诱导及其指标测定

4．2．6 统计分析

4．3 结果与分析

4．3．1 腺病毒载体感染成肌细胞

4．3．3 腺病毒MSTN干扰载体对MSTN基因相关基因的影响

4．3．4 腺病毒干扰载体对干扰素相关基因的影响

4．3．5 MSTN干扰后对成肌细胞增殖的影响

4．3．6 成肌细胞诱导分化后MSTN基因表达检测

4．3．7 成肌细胞融合率检测

4．3．8 成肌细胞诱导分化后相关基因表达变化

4．4 讨论

4．4．1 腺病毒载体的构建及干扰效果

4．4．2 腺病毒干扰载体对相关基因的影响

4．4．3 腺病毒干扰载体对绵羊成肌细胞增殖的影响

4．4．4 腺病毒干扰载体对成肌细胞分化及相关基因的影响

4．5 小结

5 基于RNA—seq对绵羊成肌细胞MSTN 基因沉默的研究

5．1 试验材料

5．1．1 试验样本

5．1．2 主要试剂和仪器

5．2 试验方法

5．2．1 样品RNA的提取

5．2．2 cDNA文库的制备

5．2．3 cDNA文库转录组测序

5．2．4 转录组测序原始数据质控

5．2．5 测序reads比对

5．2．6 基因表达量统计

5．2．7 基因差异PCA分析

5．2．8 重复性检验

5．2．9 差异统计分析

5．2．10 注释及功能预测

5．3 结果与分析

5．3．1 RNA的质量检测

5．3．2 RNA—seq原始测序数据质控

5．3．3 基因表达结果统计

5．3．5 样本重复相关性检查

5．3．6 差异统计分析

5．3．7 差异表达基因GO功能分析

5．3．8 KEGG Pathway分析

5．3．9 4个信号通路差异基因的聚类分析

5．4 讨论

5．4．1 数据质控及样本重复性

5．4．2 差异基因分析

5．4．3 GO功能分析

5．4．4 Pathway分析

5．4．5 聚类分析

5．5 小结

6．1 主要结论

6．2 创新点

6．3 下一步的研究

参考文献

附录

作者简介

致谢