灰葡萄孢BcKMO基因与信号途径关键基因的关系研究

摘要

实验室前期通过筛选灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库，获得了1株不产生菌核的突变体BCG183，明确了其突变基因为BcKMO，该基因编码犬尿氨酸单加氧酶（kynurenine3-monooxygenase，KMO）。通过构建BcKMO基因的回复突变体BCG183/BcKMO，明确了BcKMO基因正调控病菌的生长、发育，负调控病菌的致病力;确定了BcKMO基因通过影响病菌的胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力、致病相关基因及信号途径基因的表达来调控病菌的致病力。本研究利用外源蛋白重组表达技术获得了纯化的BcKMO蛋白，并确定了其具有犬尿氨酸单加氧酶活性;通过检测BcKMO基因与cAMP、MAPK途径关键基因的表达规律，分析BcKMO基因与cAMP、MAPK途径关键基因的关系;通过检测BcKMO基因突变对cAMP、MAPK途径关键基因表达的影响，以及cAMP、MAPK途径关键基因突变对BcKMO基因表达的影响，进一步分析BcKMO基因与cAMP、MAPK途径关键基因的关系。主要研究结果如下:
　　1.利用外源蛋白重组表达技术，获得了纯化的BcKMO蛋白;利用酶联免疫分析技术，确定了纯化的BcKMO蛋白具有犬尿氨酸单加氧酶活性，其酶活力为2.56U/L。
　　2.利用Real-time PCR技术，检测病菌不同发育阶段、不同组织部位及不同培养条件下BcKMO基因和cAMP、MAPK途径关键基因的表达水平。结果发现，BcKMO基因与cAMP途径关键基因pka1、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp3的表达规律基本一致，均是在7d的菌丝和菌核中表达水平较高;BcKMO基因和cAMP、MAPK途径关键基因均是在含果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高;在不同培养条件培养的病菌中，BcKMO基因的表达规律与bmp1基因基本一致。推测，BcKMO基因与cAMP途径关键基因pka1、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp1、bmp3间的关系较为密切。
　　3.利用Real-time PCR技术，对BC22、BCG183和BCG183/BcKMO菌株中BcKMO基因、cAMP关键基因(pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3)和MAPK途径关键基因（bmp1、bmp3）的表达水平进行检测。结果发现，在BcKMO基因的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp1的表达水平均明显高于野生型和回复突变体，MAPK途径关键基因bmp3的表达水平明显低于野生型和回复突变体，表明，BcKMO基因负调控cAMP途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp1的表达，正调控MAPK途径关键基因bmp3的表达。
　　4.利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，获得了cAMP途径关键基因(pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3)和MAPK途径关键基因（bmp1、bmp3）的RNAi突变体。采用Real-time PCR技术，检测各基因RNAi突变体中BcKMO基因的表达水平。结果发现，cAMP途径关键基因pka1、bcg2和MAPK途径关键基因bmp1的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平明显高于野生型，而cAMP途径关键基因pka2、pkaR、bcg3和MAPK途径关键基因bmp3基因的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平明显低于野生型，表明cAMP途径关键基因pka1、bcg2和MAPK途径关键基因bmp1负调控BcKMO基因的表达，而cAMP途径关键基因pka2、pkaR、bcg3和MAPK途径关键基因bmp3正调控BcKMO基因的表达。

目录

声明

摘要

缩写词表

1 引言

1．1 灰葡萄孢的分类地位

1．2 灰葡萄孢的致病机制

1．3 信号途径相关基因参与灰葡萄孢的生长发育和致病力

1．3．1 cAMP信号途径相关基因

1．3．2 MAPK信号途径相关基因

1．3．3 Ca2+信号途径相关基因

1．3．4 小G蛋白相关基因

1．4 犬尿氨酸单加氧酶参与灰葡萄孢的生长发育和致病力

1．5 本研究的目的与意义

2 材料和方法

2．1．3 培养基

2．1．4 主要仪器和设备

2．2 试验方法

2．2．1 灰葡萄孢基因组DNA的提取

2．2．2 灰葡萄孢RNA的提取和cDNA的合成

2．2．3 灰葡萄孢BcKMO蛋白单加氧酶活性的测定

2．2．4 灰葡萄孢BcKMO基因与cAMP、MAPK途径关键基因的表达规律分析

2．2．5 BcKMO基因突变对cAMP和MAPK途径关键基因表达的影响

2．2．6 灰葡萄孢cAMP、MAPK途径关键基因突变对BcKMO基因表达的影响

3 结果与分析

3．1 灰葡萄孢BcKMO的酶活性测定

3．1．1 BcKMO基因原核表达载体的构建

3．1．2 不同浓度的IPTG诱导对BcKMO蛋白表达的影响

3．1．3 不同诱导时间对BcKMO蛋白表达的影响

3．1．4 BcKMO-GST蛋白的纯化

3．1．5 BcKMO-GST蛋白的Western blot分析

3．1．6 BcKMO蛋白的单加氧酶活性测定

3．2 BcKMO基因与cAMP、MAPK途径关键基因的表达规律分析

3．2．1 病菌不同发育阶段、不同组织部位的基因表达分析

3．2．2 不同培养条件对BcKMO基因和cAMP、MAPK途径关键基因表达的影响

3．4 cAMP、MAPK途径关键基因突变对BcKMO基因表达的影响

3．4．1 cAMP、MAPK途径关键基因突变体构建及表型分析

3．4．2 cAMP、MAPK途径关键基因突变对BcKMO基因表达的影响

4 讨论

4．1 灰葡萄孢BcKMO基因的功能

4．2 灰葡萄孢BcKMO及cAMP、MAPK途径关键基因调控病菌致病力的机制

4．3 灰葡萄孢BcKMO基因与病菌信号途径的关系

5 结论

参考文献

在读期间发表学术论文

作者简历

致谢