马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)准性生殖现象的分析

摘要

近年来，由茄链格孢(Alternaria solani)引起的马铃薯早疫病已上升为马铃薯上的第二大叶部病害，了解其生殖方式对研究其生存与进化有至关重要的意义。本文对茄链格孢菌进行继代培养，通过细胞学观察、形态学分析、SSR分子检测和群体遗传多样性分析等方法相结合，对其是否具有准性生殖进行了研究。主要研究结果如下:
　　1.马铃薯早疫病菌的细胞学现象观察:通过比较刮取菌丝、涂抹培养基培养菌丝以及插片法三种收集菌丝的方法，确立了插片法作为细胞学观察中收集菌丝的方法。建立了DAPI染液和Calcoflour White Stain染液的双重荧光染色体系。对早疫病菌菌丝进行染色过程中发现了大量的菌丝融合及细胞核融合现象，为茄链格孢具有准性生殖提供了细胞学方面的证据。
　　2.继代培养菌株形态学性状:对继代培养菌株的菌落形态、直径和产孢量统计发现，亲代、F1代、F2代菌株直径和产孢量均呈下降趋势，且产孢量与菌落颜色深浅有相关性，菌落颜色较深的菌株分生孢子量多于菌落颜色浅的菌株。随着继代培养，角变现象呈上升趋势，亲本、F1代、F2代菌株出现角变现象的概率分别为33.33％、23.33％、52.50％。
　　3.马铃薯早疫病菌继代培养过程中染色体丢失现象:采用7对SSR引物对6株早疫病菌株及其继代培养菌株进行SSR检测。7对引物中，只在As-95236位点出现了染色体丢失现象。在亲代菌株中，引物As-95236检测到在该基因位点只有一株早疫病菌HB-6为单个等位基因，另外5株菌株为两个等位基因。在60株F1代菌株中，引物As-95236检测到在该位点存在染色体丢失现象的菌株共19株，占F1代菌株的31.67％。在40株F2代早疫病菌株中，引物As-95236检测到在该基因位点存在染色体丢失现象的菌株共30株，占F2代菌株的75％。在As-95236位点上，F1代和F2代存在染色体丢失现象的概率分别为31.67％、75％，染色体丢失率呈上升趋势。
　　4.茄链格孢菌原生质体的制备:用酶解法对茄链格孢菌原生质体制备条件进行了研究，结果表明当菌饼液体培养20h，且酶解液各组分（崩溃酶、裂解酶、蜗牛酶）浓度为1.5％，30℃下酶解3h，转速为3500rpm/min，10min时，原生质体制备率最高。同时，观测到菌丝释放原生质体的方式有三种:第一，菌丝细胞壁完全被酶解，原生质体裸露出来;第二，菌丝从一端开口，逐个释放原生质体;第三，菌丝在一侧崩裂，释放原生质体。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 准性生殖的研究进展

1．1．1 异核现象的研究进展

1．1．2 细胞核染色研究进展

1．2 马铃薯早疫病菌群体遗传多样性的研究进展

1．3 原生质体制备和核型分析

1．3．1 真菌细胞壁的组成研究

1．3．2 原生质体的研究历程

1．3．3 原生质体的应用现状

1．4 本研究的意义

2 材料与方法

2．1．3 供试培养基

2．1．4 供试试剂

2．1．5 供试SSR引物

2．2 马铃薯早疫病菌表型和基因型分析

2．2．1 马铃薯早疫病菌表型分析

2．2．2 马铃薯早疫病菌菌株SSR反应体系

2．2．3 马铃薯早疫病菌基因型统计

2．3 马铃薯早疫病菌双重荧光染色方法的确立及细胞学观察

2．3．1 菌丝的收集方法

2．3．2 分生孢子的收集

2．3．3 菌丝双重荧光染色

2．3．4 分生孢子脱色与双重荧光染色

2．4 马铃薯早疫病菌继代培养菌株的形态学观察

2．4．1 马铃薯早疫病菌株继代培养

2．4．2 马铃薯早疫病菌继代培养菌株单位面积产孢量的分析

2．4．3 方差分析

2．5 马铃薯早疫病菌继代培养菌株染色体丢失的SSR检测

2．5．1 马铃薯早疫病菌菌株SSR反应体系

2．5．2 分析继代培养菌株染色体丢失概率

2．6 马铃薯早疫病菌原生质体的制备

3 结果与分析

3．1 马铃薯早疫病菌表型和基因型的研究

3．1．1 马铃薯早疫病菌培养中出现角变现象

3．1．2 SSR检测等位基因数目

3．1．3 马铃薯早疫病菌遗传多样性高

3．1．4 亲代菌株的筛选菌株的选取

3．2 6株马铃薯早疫病菌株的表型和基因型研究

3．2．1 6株马铃薯早疫病菌菌株表型

3．2．2 6株马铃薯早疫病菌在不同基因位点的等位基因数

3．3 马铃薯早疫病菌异核体的存在和细胞核融合现象

3．3．1 插片法收集马铃薯早疫病菌菌丝

3．3．2 马铃薯早疫病菌菌丝双重荧光染色体系的建立

3．3．3 马铃薯早疫病菌分生孢子脱色及双重荧光染色体系的建立

3．3．4 马铃薯早疫病菌的细胞核数目统计

3．3．5 马铃薯早疫病菌菌丝及细胞核融合

3．4 马铃薯早疫病菌继代培养菌株中染色体丢失现象的SSR检测

3．4．1 F1代菌株染色体丢失现象分析

3．4．2 马铃薯早疫病菌F1代菌株形态统计

3．4．3 F1代菌株染色体丢失与形态学的关系

3．4．4 F2代菌株染色体丢失现象分析

3．4．5 马铃薯早疫病菌F2代菌株形态统计

3．4．6 F2代菌株染色体丢失与形态学的关系

3．4．7 马铃薯早疫病菌继代培养菌株生长量的测定

3．4．8 马铃薯早疫病菌继代培养产孢能力的测定

3．5 马铃薯早疫病菌原生质体的制备

3．5．1 马铃薯早疫病菌原生质体的形成

3．5．2 原生质体制备体系的建立

4 讨论

4．1 茄链格孢菌中大量的菌丝融合和细胞核融合

4．2 茄链格孢菌产孢能力与菌落形态的相关性

4．3 茄链格孢菌继代培养过程中染色体丢失

4．4 茄链格孢菌的角变现象

4．5 茄链格孢菌原生质体的形成的影响因素

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

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致谢