小麦与叶锈菌互作体系中自噬体膜来源及自噬功能探究

摘要

本试验利用小麦品种L10与叶锈菌生理小种260和165分别构成不亲和与亲和组合，对自噬体膜来源和功能进行探究。本实验室前期工作利用电镜观察到不亲和组合中寄主发生HR的细胞内有自噬泡存在，采用RNAi和VIGS技术对小麦品种L10中自噬相关基因TaATG8进行沉默，发现在基因沉默植株中HR面积明显大于对照植株，而且吸器母细胞数量也有所增加，证明了不亲和组合中自噬对HR有重要调控作用。为了更加深入了解在该体系自噬形成过程中膜的来源以及自噬对HR的可能调控方式，本论文设计了一系列免疫组化试验，对不亲和互作体系中自噬体膜的来源和自噬体包裹内含物的去路进行研究;同时又对亲和组合中的自噬进行了观察和功能初探，获得的主要结果如下:
　　1.当利用Anti-ATG8作为一抗对不亲和组合叶片进行免疫金标记时，发现发生HR的细胞中有大量疑似自噬泡的膜上被标记上金颗粒。这一结果确证了不亲和组合中自噬体的存在。
　　2.利用特异性抗体包括线粒体内膜蛋白抗体和液泡膜蛋白抗体分别作为一抗对不亲和组合叶片进行标记时，发现金颗粒均被标记在自噬体膜上，说明自噬体膜上存在这些蛋白组分。
　　3.利用特异性抗体包括线粒体内膜蛋白抗体和叶绿体基质蛋白抗体分别作为一抗对不亲和组合叶片进行标记时，发现自噬体可以包裹线粒体和叶绿体基质蛋白进行降解。
　　4.利用Anti-ATG8作为一抗进行标记时，发现金颗粒被标记在发生HR的细胞与邻近健康细胞之间的胞间连丝上，推测自噬体可能将HR细胞中的内含物包裹起来通过胞间连丝快速运往邻近健康细胞，以此来加速HR细胞的死亡进程。
　　5.在亲和组合的接种后期，观察到被菌侵染的细胞中存在大量自噬体，暗示着自噬在这种亲和关系的建立中可能发挥重要作用。
　　6.利用VIGS技术沉默L10中的TaATG8基因后再接种165，结果表明，与未沉默植株相比，在侵染点处菌丝团的生长发育并没有很大差别，且叶片表面的孢子堆的大小也无差别，说明沉默TaATG8后对菌的发育可能没有影响。

目录

声明

摘要

英文缩写表

1．引言

2．1主要试验材料

2．2主要试验仪器

2．3主要试验试剂

2．4主要引物

3．主要试验内容及方法

3．1小麦幼苗培养以及叶锈菌繁殖

3．1．1幼苗培养

3．1．2叶锈菌繁殖

3．2透射电镜样品包埋块的制备

3．2．1样品取样

3．2．2材料的固定及电镜包埋块制作

3．3透射电镜样品的切片及常规染色和免疫金标记

3．3．1透射电镜样品的切片

3．3．2透射电镜样品的常规染色

3．3．3透射电镜样品的免疫金标记

3．4 TaATG8基因VIGS载体的构建及转染小麦

3．4．1 TaATG8基因VIGS载体的构建

3．4．2小麦转染所需病毒获得

3．4．3 BSMV转染小麦

3．5 TaATG8基因沉默效率检测及功能分析

3．5．1 TaATG8的表达量检测

3．5．2 TaATG8基因沉默后对叶锈菌发育的影响

4．结果与分析

4．1不亲和组合中自噬体膜来源及其包裹内含物成分和去路探究

4．1．1半薄切片定位叶锈菌及其侵染的寄主细胞

4．1．2 HR细胞内自噬体膜来源探究

4．1．3不亲和组合HR细胞中自噬体包裹内含物成分和去路探究

4．2亲和组合中的自噬体观察及其功能分析

4．2．1亲和组合中自噬体的电镜观察

4．2．2亲和组合中自噬相关基因TaATG8基因沉默对菌发育的影响

5．讨论与展望

6．结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢