玉米大斑病菌有性生殖的影响因素及StMAT1-1基因功能分析

摘要

玉米生长过程中受多种病虫害影响，大斑病是其中的主要叶部病害之一，引起该病的病原菌为玉米大斑病菌，有性型为大斑刚毛座腔菌[Setosphaeria turcica(Luttrell)Leonard et Syggs]。病菌中控制有性生殖的交配型基因包含StMAT1-1和StMAT1-2，分别编码α1转录因子和高迁移率蛋白(high mobility group，HMG)。有性态诱导组合中需同时含有以上两种交配型基因的菌株才能在适宜条件下相互识别、融合，完成质配、核配、减数分裂，产生有性后代。本研究系统监测了田间菌株的交配型组成，针对有性态产生条件不确定的现状，系统分析了影响大斑病菌有性生殖的因素，通过创制并分析StMAT1-1基因缺失突变体，初步探讨StMAT1-1在调控大斑病菌有性生殖中的功能，主要结果如下:
　　1.根据交配型StMAT1-1和StMAT1-2基因序列设计特异引物，对2011-2016年田间采集获得的664份玉米大斑病菌进行了交配型组成鉴定，其中带StMAT1-1基因的菌株（A交配型）有46份，占6.93％;带StMAT1-2基因的菌株（a交配型）585份，占88.10％;同时带StMAT1-1和StMAT1-2基因的菌株（Aa交配型）33份，占4.97％;说明田间玉米大斑病菌以a交配型菌株为主;
　　2.对玉米大斑病菌有性态诱导条件进行优化，温度25℃、相对湿度55％、玉米叶片为诱导介质、外源添加0.12g/L的FeCl3和0.85g/L CaCO3、光照培养，有利于有性态子囊壳的产生，同等条件下黑暗培养更利于有性态子囊壳成熟;
　　3.构建了StMAT1-1基因酵母诱饵表达载体，缺陷培养证实StMAT1-1基因编码蛋白产物有较高的转录激活活性，为转录调控因子;构建了StMAT1-1基因敲除质粒，成功转入到玉米大斑病菌A交配型菌株的基因组，经潮霉素抗性筛选、特异片段PCR扩增、Southern blot杂交验证，获得了2株StMAT1-1基因缺失突变体;对突变体ΔStMAT1-1-21和ΔStMAT1-1-24的生长、发育、繁殖能力进行分析，结果表明，StMAT1-1基因缺失导致了突变体营养生长旺盛，产孢能力几乎丧失，不能进行有性生殖;
　　4.通过与其他致病菌已知有性繁殖相关基因进行比对，获得玉米大斑病菌同源基因12个，利用实时定量PCR检测有性态诱导过程中有性生殖相关基因的相对表达量，结果显示，大多数与有性生殖相关的基因在子囊壳形成前期相对表达量较高，比较活跃，子囊壳成熟后这些基因的相对表达量普遍降低。

目录

声明

摘要

缩写词

1．1玉米大斑病及发生现状

1．2真菌的有性发育

1．2．1子囊菌的有性生殖

1．2．2玉米大斑病菌的有性生殖

1．3 MAT基因与有性生殖的关系

1．4研究意义和目的

2．1．1试验材料

2．1．2溶液和药品配方

2．1．3培养基配方

2．1．4试验仪器

2．2病菌的分离纯化及保存

2．3病菌交配型组成鉴定

2．4玉米大斑病菌有性生殖的影响因素分析

2．4．1不同交配型菌株有性生殖能力分析

2．4．2子囊孢子成熟的影响因素分析

2．5转录因子StMAT1-1白激活活性检测

2．5．2 StMAT1-1基因自激活活性检测

2．6 StMAT1-1基因缺失菌株的创制

2．6．2 StMAT1-1基因敲除载体的构建

2．7 StMAT1-1基因敲除突变体的创制

2．7．1 PEG介导的原生质体转化

2．7．2农杆菌介导的原生质体转化

2．7．3 ΔStMAT1-1突变体的验证

2．8突变体ΔStMAT1-1的分析

2．8．4有性生殖相关基因的表达分析

3结果与分析

3．1玉米大斑病菌的交配型组成

3．2玉米大斑病菌有性态产生的最佳条件

3．2．1不同交配型菌株的有性生殖能力

3．2．2玉米大斑病菌有性繁殖过程

3．2．3子囊孢子成熟的影响因素

3．3 StMAT1-1基因的自激活活性

3．3．2自激活诱饵载体pGBKT7-StMAT1-1

3．4玉米大斑病菌StMAT1-1突变体的获得

3．4．2农杆菌介导的StMAT1-1敲除载体的获得

3．4．2 StMAT1-1突变体的获得

3．4．3突变体AStMAT1-1的表达量

3．5 StMAT1-1突变体的特性

3．5．1不同培养基上突变体的菌落形态

3．5．2突变体的营养生长及无性繁殖能力

3．5．4生殖相关基因的表达量分析

4讨论

4．1环境条件与真菌有性生殖的关系

4．2真菌交配型基因MAT的结构和功能

4．3交配型基因对生殖相关基因的调控作用

5结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢