玉米HSP70家族成员的鉴定及抗旱基因的筛选和功能分析

摘要

玉米作为三大重要的粮食作物之一，在整个生育周期内，干旱成为影响玉米生长发育最重要的逆境因子。热激蛋白70(heat shock protein70，HSP70)是一类高度保守的分子伴侣，在生物体遭受逆境胁迫时被激活表达。已有研究中发现HSP70在植物响应逆境胁迫时起着重要的作用。然而，关于玉米HSP70的功能研究知之甚少。本研究通过对玉米基因组数据进行分析，鉴定获得HSP70家族成员，并对家族成员进行深入分析，筛选出可能参与玉米抗旱的HSP70成员，进而对这些成员进行了初步功能研究。
　　首先，利用生物信息学方法鉴定出41个玉米HSP70家族成员，通过与拟南芥、水稻HSP70家族成员构建进化树，结果显示ZmHSP70在进化树上的分布符合HSP70两个亚家族。其中25个成员属于DnaK亚家族，16个成员属于HSP110/SSE亚家族。亚细胞定位预测结果显示41个玉米HSP70成员中23个定位于细胞质，8个定位于内质网，8个定位于叶绿体，2个定位于线粒体。通过对玉米HSP70成员的蛋白结构进行分析，发现每个成员都含有HSP70的典型保守基序，这一结果验证了所鉴定家族成员的准确性。
　　其次，通过对基因启动子区逆境和激素相关元件分析，筛选出响应干旱胁迫的候选基因。进一步在干旱胁迫下，通过转录水平的半定量和实时定量PCR检测玉米候选基因的表达情况，结果可见ZmHSP70-1，ZmHSP70-2.1、ZmHSP70-8受干旱诱导表达明显增强，推测这些成员可能在干旱逆境信号通路中发挥功能。
　　接下来通过瞬时转化烟草，观察ZmHSP70-1、ZmHSP70-2.1、ZmHSP70-8在细胞中的定位。激光共聚焦显微镜观察结果显示这三个成员都定位于细胞质/核，这与生物信息学预测结果一致，也和蛋白序列所包含的相关定位基序相吻合。
　　通过构建ZmHSP70-1、ZmHSP70-8超表达载体并转化拟南芥，获得拟南芥超表达植株;土壤干旱试验结果可见两个过表达材料都表现出干旱胁迫条件长势优于野生型和突变体，皿中甘露醇处理下的移苗试验也同样可见过表达植株长势好于野生型和突变体，表明ZmHSP70-1、ZmHSP70-8基因参与了幼苗及成苗期的干旱胁迫响应过程。盐处理条件下的萌发试验发现，ZmHSP70-1、ZmHSP70-8超表达株系表现出耐盐表型，萌发率明显高于野生型和突变体。
　　综上所述，玉米HSP70家族是一个多基因家族，ZmHSP70-1、Zm HSP70-8在玉米响应干旱逆境过程中发挥着正调节因子作用。本研究对玉米抗旱相关基因筛选具有一定意义，有助于进一步对玉米抗旱基因功能机制开展深入研究。

目录

声明

摘要

英文缩写表

1引言

1．1热激蛋白

1．2热激蛋白70

1．2．1热激蛋白70结构

1．2．2 HSP70与HSP40、HSP110的关系

1．2．3热激蛋白70分类

1．2．4植物热激蛋白70的生物学功能

1．2．5 HSP70与非生物胁迫

1．2．6 HSP70研究现状

1．3研究目的及意义

2．1供试玉米

2．2菌株和质粒载体

2．3主要仪器设备

2．4主要试剂

2．5主要培养基及溶液配置

2．5．1常用溶液配制

2．5．2常用抗生素配制

2．5．3常用培养基配制

3试验方法

3．1玉米HSP70家族成员的挖掘及生物信息学分析

3．1．1基因家族成员鉴定

3．1．2系统进化分析

3．1．3基因结构、染色体定位及保守基序分析

3．1．4蛋白结构域及蛋白高级结构分析

3．1．5启动子顺式元件

3．1．6基因表达分析

3．2玉米HSP70家族抗旱相关基因的筛选

3．2．1材料处理

3．2．2玉米RNA的提取

3．2．3反转录获得cDNA

3．2．4基因半定量RT-PCR

3．2．5基因实时定量PCR

3．2．6实时定量结果计算

3．3载体构建

3．3．1总RNA提取

3．3．2反转录获得cDNA

3．3．3目的基因的扩增

3．3．4 PCR产物的回收

3．3．5 pEASY-Blunt Simple Cloning Kit与胶回收产物连接

3．3．6连接产物转化

3．3．7阳性克隆的鉴定

3．3．8阳性克隆测序

3．3．9目的基因与目的载体连接

3．3．10农杆菌感受态细胞的制备

3．3．11农杆菌转化

3．3．12农杆菌单克隆验证

3．4亚细胞定位

3．4．1转化烟草叶片

3．4．2亚细胞定位观察

3．5拟南芥材料

3．5．1拟南芥种植

3．5．2 CTAB法提取基因组

3．5．3 PCR鉴定纯合突变体

3．6拟南芥超表达植株转化及纯合种子筛选

3．6．1拟南芥超表达植株转化

3．6．2纯合种子筛选

3．7拟南芥胁迫相关生理表型试验

3．7．1拟南芥土壤干旱试验

3．7．2拟南芥皿上胁迫试验

3．8试验所用引物

4试验结果

4．1玉米HSP70家族成员的挖掘及生物信息学分析

4．1．1 ZmHSP70s基因鉴定和命名

4．1．2基因家族进化树分析

4．1．3 ZmHSP70s基因在染色体上的分布

4．1．4ZmHSP70s基因结构分析

4．1．5玉米HSP70s保守基序分析

4．1．6玉米HSP70s蛋白结构域分析

4．1．7蛋白质高级结构预测分析

4．1．8 ZmHSP70s基因表达模式分析

4．1．9启动子激素及逆境相关顺式元件分析

4．2玉米HSP70抗旱相关基因的筛选

4．2．1 RT-PCR筛选干旱诱导基因

4．2．2 RT-qPCR验证干旱诱导候选基因

4．2．3 ZmHSP70s基因的组织表达

4．3 ZmHSP70s基因亚细胞定位

4．3．1亚细胞定位载体构建

4．3．2亚细胞定位观察

4．4 ZmHSP70s基因功能研究

4．4．1超表达载体构建

4．4．2超表达株系的基因表达量检测

4．4．3突变体验纯

4．4．4超表达株系的干旱表型检测

4．4．5胁迫处理下的发芽率检测

5讨论

6结论

参考文献

在读期间参与的课题和发表的论文

作者简历

致谢