趋化因子在猪流行性腹泻病毒感染中的作用

摘要

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起猪的一种急性、接触性肠道传染病，该病以腹泻、呕吐、脱水、急性肠炎为特征。近年来PEDV导致大批仔猪死亡，给养猪业造成了巨大经济损失，但目前对其感染免疫机制的了解尚不深入。趋化因子是募集白细胞至感染部位的一类低分子量蛋白质，其趋化作用是炎症发生过程中重要的起始步骤，也是机体天然免疫功能的一个重要方面。本研究围绕PEDV感染免疫选题，通过体内外试验，探索趋化因子在PEDV感染中的作用，旨在为深入阐明PEDV的感染免疫机制提供科学依据。
　　将6头21日龄健康仔猪随机分为PEDV强毒株感染组和阴性对照组。感染组每头口服接种1.5×106.6TCID50的PEDV;对照组接种等体积的细胞维持液。感染后3d应用基因表达谱芯片技术和FQ-PCR检测回肠组织中趋化因子mRNA的表达量。结果表明，感染猪回肠组织中趋化因子MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13的mRNA表达水平显著上调(P＜0.05)。为了验证PEDV强毒株感染宿主细胞后趋化因子表达水平的变化，将IPEC-J2细胞分为HBQY2016强毒株感染组、CV777弱毒株感染组、LPS阳性对照组和阴性对照组。两个病毒感染组分别接种0.5MOI的HBQY2016强毒株和CV777弱毒株，阳性对照组用10μg/mL的LPS刺激，阴性对照组加入等体积的维持液。感染后18～20h收集细胞，两个病毒感染组的MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9和CXCL13mRNA的表达水平显著上升(P＜0.05)，细胞上清中MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13水平显著升高(P＜0.05)。
　　为了进一步阐明趋化因子在PEDV感染中的作用，设计合成并筛选了分别对MCP-1、CXCL9、CXCL13具有较高抑制活性的siRNA，并将IPEC-J2细胞分为PEDV感染组(强/弱毒株)、siRNA干扰-(强/弱毒株)感染组、siRNA阴性(NC)-PEDV(强/弱毒株)感染对照组和阴性对照组。通过Transwell趋化试验和流式细胞术分析，与病毒感染组相比，MCP-1干扰-HBQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组细胞下室内CD14+单核细胞的个数分别下降400个细胞(P＜0.05)和1152个细胞(P＜0.05);CXCL9干扰-HBQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组的CD3+CD4-CD8-γδT、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th和CD3+CD4+CD8+Tm细胞亚群的个数分别下调677、258、718、207个细胞和2605、533、2729、949个细胞，均差异显著(P＜0.05);CXCL13干扰-HBQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组的CD19+B细胞亚群的平均百分含量分别下降279个细胞(P＜0.05)和164个细胞(P＜0.05)。
　　上述体内外实验证明，PEDV强毒株感染引起趋化因子(MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13)表达量显著上调，其中强毒株、弱毒株诱导产生的MCP-1对CD14+单核细胞，CXCL13对CD19+B细胞具有趋化作用;强毒株和弱毒株诱导产生的CXCL9均对CD3+CD4-CD8-γδT、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th和CD3+CD4+CD8+Tm细胞亚群具有趋化作用。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1引言

1．1猪流行性腹泻病毒

1．1．1病毒粒子结构和理化特性

1．1．2编码的蛋白及其功能

1．1．3 PEDV的培养特性

1．1．4 PED的流行

1．1．5 PEDV的遗传变异

1．1．6致病性

1．2 PEDV的靶细胞

1．2．1 IPEC-J2／IPEC-1细胞

1．2．2 IECs

1．3 PEDV诱导的免疫应答

1．3．1全身性免疫应答

1．3．2固有黏膜免疫应答

1．4趋化因子

1．5研究目的与意义

1．6研究内容和技术路线

1．6．1研究内容

1．6．2技术路线

1．7研究目标

2．1．1细胞及毒株

2．1．2实验动物

2．1．3主要试剂与试剂盒

2．1．4流式用抗体

2．1．5主要试剂的配制

2．1．6主要设备

2．2方法

2．2．1引物合成

2．2．2病毒培养与TCID50测定

2．2．3 FQ-PCR标准曲线的建立

2．2．4 PEDV感染仔猪回肠组织中差异表达基因的检测

2．2．5细胞因子mRNA表达水平的FQ-PCR检测

2．2．6体外PEDV感染试验最佳细胞系的筛选

2．2．7趋化因子对仔猪外周血白细胞趋化作用的检测

3结果与分析

3．1．1趋化因子FQ-PCR标准曲线

3．1．2 PEDV N基因FQ-PCR标准曲线

3．2感染仔猪回肠组织中趋化因子差异表达基因

3．2．1 RNA的质量

3．2．2样品主成分分析

3．2．3火山图

3．2．4 GO分析

3．2．5 KEGG Pathway富集分析

3．2．6趋化因子差异基因

3．3仔猪回肠组织中趋化因子mRNA的表达量

3．3．1 FQ-PCR检测

3．3．2 FQ-PCR检测结果与表达谱芯片检测结果对比

3．4 PEDV体外最佳感染细胞系的确定

3．4．1病毒核酸载量

3．4．2病毒抗原

3．4．3 TCID50

3．4．4趋化因子mRNA的表达水平

3．4．5感染细胞上清中的趋化因子浓度

3．5 MCP．1、CXCL9、CXCLl3对白细胞的趋化作用

3．5．1趋化因子高抑制活性siRNA

3．5．2 MCP-1、CXCL9、CXCLl3对仔猪外周血白细胞的趋化作用

4讨论

4．1 PEDV感染仔猪后回肠组织中趋化因子mRNA的表达水平

4．2 PEDV体外感染最佳细胞系的选择

4．3趋化因子对仔猪外周血白细胞的趋化作用

6结论

参考文献

在读期间发表的学术论文与获得的研究成果

作者简介

致谢