分枝状PEI在不同细胞系效率和细胞毒性间的关系

摘要

背景：
　　基因治疗能将外源正常基因导入靶细胞并使之有效表达，从而达到治疗目的，是一种新兴的治疗方法。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是一种高效的非病毒性基因转染载体，其枝状复合物尤其是25 kDa的分支状PEI有较高的基因转染效率，它在基因传递领域的应用非常广泛。同时PEI对细胞也有毒副作用，它的毒性与相对分子质量(Mr)有关，不同Mr或异构体的PEI，在体内介导基因转染的效率和细胞毒性截然不同。本课题将在不同的细胞系中研究其转染效率和毒性间的关系，并尝试探讨其分子机制。
　　目的：
　　本研究拟确定PEI对不同细胞的转染效率和细胞毒性之间的内在联系，同时优化PEI基因转染的条件，确定转染时机及最优用量，并分析PEI在BMSC细胞中可能的分子机制。
　　方法：
　　1.PEI在不同细胞系中基因转染效率和细胞毒性之间的关系不同哺乳动物细胞系293T、Hela和BMSC细胞培养后，悬浮转染pEGFP质粒与PEI的复合物，分别孵育24 h和48 h，利用荧光细胞计数法分析转染效率;悬浮转染pLuc(luciferase基因来自Renilla)质粒与PEI的复合物，利用分光光度计分析各细胞的荧光素酶活性;采用MTT比色法分析PEI对293T、Hela和BMSC细胞的毒性，Western印迹检测细胞毒性标记物一水解的(cleaved) PARP和水解的caspase-3，进而得出转染效率和毒性之间的相关性。
　　2.PEI介导的BMSC细胞转染可能的分子机制
　　构建caveolin-1过表达质粒，经PEI转染BMSC细胞，Western印迹法检测其对转染效率和毒性的影响。
　　结果：
　　1.PEI对293T、Hela和BMSC3种细胞的细胞毒性和转染效率呈正相关，即转染效率越高，PEI的细胞毒性亦越高:
　　①荧光素酶活性检测结果显示PEI∶DNA(μg∶μg)的比率为2(4μg PEI∶2μgDNA)时，转染效率最高。
　　②不同时间点转染的结果表明转染时间之间的差异不显著。
　　③pEGFP表达质粒转染293T、Hela和BMSC细胞的转染效率结果是:92.1±4.5％，29.2±3.4％和21.5±2.1％。
　　④荧光素酶报告基因转染293T、Hela和BMSC细胞后荧光素酶活性分别是:2.873×108、3.35×107、1.94×107 RLU/mg protein。
　　⑤MTT法结果显示PEI转染pLuc DNA后死细胞百分比分别是66.1±2.1％，55.9±2.5％和45.1％±6.7％，这与Western印迹结果一致，即PEI的细胞毒性:293T＞Hela＞BMSC细胞。
　　2.Caveolin-1过表达时可提高对BMSC细胞的转染效率和毒性。
　　结论：
　　1.PEI在各种细胞系的转染效率与PEI的毒性呈正相关性。
　　2.Caveolin-1通过胞吞作用参与PEI介导的细胞转染，可以PEI作为基因载体用于基因治疗。

目录

声明

摘要

前言

第一部分：PEI在不同细胞系中基因转染效率和细胞毒性的关系

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分 Caveolin-1对细胞转染效率及毒性的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

综述 PEI聚合物纳米颗粒用于体内基因传递的研究进展

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢

个人简历