NaCl胁迫下甘草子叶愈伤组织高产黄酮细胞系的筛选及其RNA提取

摘要

甘草是我国最常用的药材，在中药处方中地位极高，而且既可以药用也可以食用。目前被广泛应用于食品、化妆品、保健品、医药的行业，年需求量大。近年来由于人们对野生甘草狂挖滥采，野生甘草遭到毁灭性破坏，人工种植的甘草因诸多客观条件限制使得甘草产量和质量均不理想，进而影响到甘草的药用价值。目前，从本质上改善甘草药材质量是亟待解决的关键问题。
　　本研究以胀果甘草子叶愈伤组织为材料，以不同浓度NaCl进行胁迫处理，研究了NaCl胁迫对胀果甘草子叶愈伤组织生长量、生理指标和黄酮含量的影响，筛选出甘草黄酮高产细胞系。用相同方法和条件对胀果甘草无菌苗做了胁迫处理，结果表明甘草无菌苗的生长状态、生理指标和黄酮含量等与85.5mmol/LNaCl浓度胁迫下的甘草黄酮高产细胞系的各种指标变化趋势基本一致。对获得的甘草黄酮高产细胞系进行了特征分析。用改良的Trizol法提取了黄酮高产细胞系总RNA以及未经NaCl处理的对照组愈伤组织的总RNA，为下一步用SSH法构建cDNA差减文库提供了所需的RNA，为揭示甘草黄酮合成机制和代谢途径相关功能基因的分离做了前期准备。主要研究结果包括：
　　（1）对胀果甘草子叶愈伤组织的相对生长量进行分析，结果表明，42.7mmol/L的NaCl能促进胀果甘草子叶愈伤组织的生长。85.5mmol/L的NaCl是胀果甘草子叶愈伤组织的阈值，超过阈值后，甘草子叶愈伤组织的生长明显被抑制，材料严重褐化、水渍化。
　　（2）用NaCl胁迫胀果甘草子叶愈伤组织的方法筛选出了甘草黄酮高产细胞系，并对甘草黄酮高产细胞系进行了特征分析。结果表明当NaCl浓度为85.5mmol/L时，胀果甘草子叶愈伤组织的黄酮含量明显升高，黄酮含量动态分析表明在培养第28d左右黄酮含量达到最大值，在盐胁迫28d和35d时，其黄酮含量极显著高于未经盐处理的对照组（p＜0.01），分别增加了0.1mg/g和0.16mg/g。85.5mmol/LNaCl胁迫下的胀果甘草子叶愈伤组织在固体MS继代培养基上呈现出“S”型生长曲线，其适应期与42.7mmol/L的NaCl处理组明显延长，在第30d左右对数生长末期的细胞生长状态仍很活跃，细胞呈现圆形，细胞质浓厚，细胞核明显，适合愈伤组织的继代培养。85.5mmol/LNaCl胁迫下的胀果甘草子叶愈伤组织中的PAL活性显著（p＜0.05）高于对照组。
　　（3）以85.5mmol/LNaCl处理的黄酮高产细胞系为实验组，以未经NaCl处理的胀果甘草子叶愈伤组织为对照组，用改良的Trizol法提取胀果甘草子叶愈伤组织的总RNA，电泳检测条带清晰完整，紫外检测纯度符合要求。
　　研究表明适当NaCl胁迫可以提高胀果甘草黄酮含量，细胞生长良好，用改良的Trizol法提取的总RNA质量高，可应用于后续分子生物学的研究。

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第1章 文献综述

1.1 甘草基本特征

1.2 甘草愈伤组织的研究进展

1.3 甘草黄酮的研究进展

1.4 NaCl胁迫提高甘草黄酮的研究进展

1.5 本研究的目的及意义

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第3章 结果分析

3.1 NaCl胁迫对胀果甘草子叶愈伤组织的影响

3.2 NaCl胁迫对甘草幼苗生长及其生理指标影响

3.3 高产细胞系的特征

3.4 总RNA的提取

第4章 讨 论

4.1 NaCl胁迫对胀果甘草生长状态的影响

4.2 NaCl胁迫对胀果甘草总黄酮含量的影响

4.3 胀果甘草子叶愈伤组织的RNA提取及多糖的去除

第5章 结 论

参考文献

致 谢

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