金银花根围AM真菌遗传多样性季节性变化研究

摘要

AM（Arbuscular Mycorrhizal）真菌能与大多数陆生植物形成共生体系，也是目前报道的与植物关系最为密切的土壤微生物之一。对维持生态系统营养循环、土壤肥力以及植物健康生长有重要作用。
　　金银花（Lonicera japonica）又名忍冬，为忍冬科忍冬属多年生半常绿缠绕木质藤本植物，是我国传统中药材之一。但在种植过程中极易受成活率低、病虫害、连作障碍等问题影响，导致金银花产量和品质逐年下降。
　　目前对于金银花研究主要集中于化学成分及药理药性，与其共生的AM真菌报道很少。本试验于2011年3月、6月、9月和12月在河北省安国市中药材基地分0~10、10~20和20~30 cm3个土层采集金银花根围土壤，应用PCR-DGGE结合克隆测序技术研究金银花根围AM真菌遗传多样性季节变化规律及影响因素，为深入了解AM真菌、宿主植物和土壤环境之间关系，利用菌根生物技术提高金银花产量和品质提供依据。主要取得以下试验结果：
　　1.电泳条件对DGGE图谱及后续试验有显著影响，利用AM真菌NS31/Glol区域确定金银花根围AM真菌最佳DGGE条件为：丙烯酰胺浓度8%、PCR产物上样量25μL、变性剂范围40%~60%、电泳时间8h、电压130V、温度60℃。
　　2.4个季节共分离出15条AM真菌条带。AM真菌丰富度、香农-威纳指数和均匀度从春季到冬季先降后升，夏季最低。土壤采样深度对AM真菌多样性有显著影响，随土层加深AM真菌多样性指数降低。聚类分析表明，不同季节AM真菌群落组成差异显著，但总体来说冬季和春季群落结构相似性高，夏季和秋季相似性高。
　　3.主成分和相关性分析表明，AM真菌丰富度和香农-威纳指数与土壤速效P和全N显著正相关，与pH显著负相关；辛普森多样性指数与土壤全N显著正相关，与pH显著负相关，其中全N影响最大，随全N含量升高，AM真菌丰富度、多样性指数先升后降。说明金银花根围AM真菌多样性季节性变化与土壤因子密切相关。
　　4.在DGGE图谱的15条带谱中选取10条清晰粗亮的AM真菌优势条带测序，通过同源性比对发现，这10个序列均与未培养球囊霉属种类相似性达到95%以上，有的甚至高达100%，说明金银花根围AM真菌优势菌群为球囊霉属。
　　5.系统发育分析表明，10条优势条带聚为5个分子种，即Glo-A、Glo-B、Glo-C、Glo-D、Glo-E，序列比对发现5个分子种的碱基组成在种间差异显著，但种内差异不大。其中， Glo-A和Glo-E分布于4个季节各个土层，说明季节变化对这两个分子种影响不大，4个季节均未出现特有种。

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第1章 文献综述

1.1 金银花研究进展

1.2 药用植物 AM真菌研究进展

1.3 AM真菌多样性

1.4 影响AM真菌多样性的生态因子

1.5 DGGE技术在AM真菌研究中的应用

第2章 材料与方法

2.1 研究区域概况

2.2 样品采集

2.3 研究方法

第3章 结果与分析

3.1 样品DNA提取

3.2 nested-PCR结果

3.3 DGGE结果

3.4 DGGE条带克隆与测序结果

3.5 土壤因子分析

3.6 AM真菌遗传多样性和土壤因子相关性分析

第4章 讨 论

4.1 土壤DNA提取

4.2 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析

4.3 AM真菌季节性变化及其影响因素

第5章 结 论

参考文献

致 谢

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