何首乌饮对自然衰老大鼠精子质量的影响

摘要

何首乌饮由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊霍、丹参、茯苓六味中药配方而成。
　　目的:研究何首乌饮对自然衰老大鼠精子质量的影响。
　　方法:
　　1.实验动物与分组
　　选用12月龄Wistar大鼠70只,将动物分为青年对照组,自然衰老组,何首乌丸组,何首乌饮1组、2组。青年对照组在12月时取材;自然衰老组在饲养到16月时灌胃等量的生理盐水;何首乌饮组1组大鼠在饲养到16月时灌胃何首乌饮60d,何首乌饮2组在饲养到17月时灌胃何首乌饮30d;何首乌丸组在饲养到16月时灌胃何首乌丸60d。
　　2.样本的收集
　　大鼠称重后,水合氯醛麻醉,内眦眶后静脉丛取血2 ml,离心后取上清液用于检测血清睾酮的浓度。酒精消毒,取附睾尾部,用生理盐水漂洗2次,剪3刀,置于盛有1 ml37℃生理盐水冻存管中,37℃水浴箱中孵育30 min,检测精子质量。取睾丸,称量,计算睾丸指数。
　　3.观察指标
　　3.1.血清睾酮浓度测定:采用生物化学发光法检测各组大鼠血清睾酮的浓度。
　　3.2.大鼠睾丸指数的计算:睾丸指数=睾丸湿重/体重×100％。
　　3.3.光镜观察:睾丸组织采用常规处理,HE染色,观察睾丸组织形态学变化。
　　3.4.精子质膜完整性观察:采用乙酰乙酸盐+碘化丙啶染色法,从冻存管中取出新收集的精子悬液,离心后去上清,PBS洗涤2次,调整精子浓度至5×106/ml,加入乙酰乙酸盐染液使其终浓度至20μg/mL,37℃避光染色3 min,然后加入碘化丙啶染液使其终浓度至5μg/mL,染色3 min,涂片后用荧光显微镜计数200个精子(头部绿色荧光的为质膜完整的精子,红色荧光为质膜破损的精子),计算头部绿色荧光的精子的百分数。
　　3.5.精子线粒体功能检测:从冻存管中取出新收集的精子悬液离心后去上清,PBS洗涤2次,离心去上清,加入100μl20μg/ml的罗丹明123,37℃避光染色30 min,用0.1 M PBS调至精子浓度至5×106/ml,荧光显微镜下观察,发绿色荧光的精子线粒体功能正常,而发弱荧光或荧光出现分节现象说明线粒体功能减弱。计数200个精子,计算发绿色荧光精子的百分数。
　　3.6.精子DNA完整性检测:采用精子DNA吖啶橙荧光检测试剂盒检测精子DNA完整性。从冻存管中取出新收集的精子悬液放入EP管中,离心去上清,加入1 ml清洁液 A洗涤2次,离心去上清,调精子浓度至5×106/ml,涂片,晾干后加入200μl固定液B,室温固定2h,滴加染色液 C,室温避光染色5min,然后用清洁液 A冲洗2～3次,荧光显微镜观察,头部发绿色荧光的为 DNA正常精子,发红色或黄色荧光的DNA异常精子。计数200个精子中头部发绿色荧光的精子百分数。
　　结果:
　　1.自然衰老组血清睾酮含量明显低于青年对照组(P<0.01),何首乌饮1、2组和何首乌丸组均能不同程度提高睾酮的浓度,与自然衰老组比较,显著升高(P<0.05),且何首乌饮1组睾酮浓度升高最为显著。
　　2.自然衰老组大鼠睾丸指数比青年对照组显著下降(P<0.01);何首乌饮1、2组和何首乌丸组睾丸指数比自然衰老组大鼠显著增加,何首乌饮1组疗效最佳。
　　3.青年对照组,睾丸生精小管边界整齐,无萎缩及塌陷,界膜完整,无增厚及纤维化;管腔内可见排列整齐的各级生精细胞和支持细胞,管腔内可见精子。自然衰老组,睾丸生精小管基膜部分增厚,边界不完整,有萎缩和塌陷,生精细胞层数明显减少,细胞稀疏;何首乌饮和何首乌丸干预后大鼠睾丸生精小管的形态结构明显改善,基膜趋于完整,生精上皮细胞层数增多,何首乌饮1组明显好于其他各组。
　　4.质膜完整性检测结果显示:自然衰老组大鼠发绿色荧光的精子数量比青年对照组显著下降(P<0.01);而何首乌饮1、2组和何首乌丸组发绿色荧光的精子数比自然衰老组大鼠显著增多,且何首乌饮1组疗效好于其余各组。
　　5.精子线粒体功能检测结果显示:自然衰老组大鼠发绿色荧光精子数量比青年对照组显著下降(P<0.01);而何首乌饮1、2组和何首乌丸组发绿色荧光的精子比自然衰老组大鼠显著增多,且何首乌饮1组疗效最佳。
　　6.精子DNA完整性检测结果显示:自然衰老组大鼠头部发绿色荧光精子数量明显减少,发红色或黄色荧光的DNA异常精子显著增多,与青年对照组比较有显著性差异(P<0.01);而何首乌饮和何首乌丸组头部发绿色荧光的精子比自然衰老组大鼠显著增多,且何首乌饮1组头部发绿色荧光的精子明显多于其余各组。
　　结论:何首乌饮能够提高衰老大鼠血清睾酮的浓度,改善睾丸组织形态结构,提高睾丸指数,具有明显提高精子质量的作用。

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第1章 绪论

1.1 精子发生的调控机制

1.1.1 激素的调控

1.1.2 细胞因子的调控

1.1.3 基因调控

1.2 影响精子质量的因素

1.2.1 物理因素

1.2.2 化学因素

1.2.3 生活方式

1.3 改善精子质量的方法

1.4 本工作的研究目的和意义

第2章 实验研究

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 实验动物

2.2.2 药品与试剂

2.2.3 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 中药复方的配制

2.3.2 实验动物模型分组与给药

2.3.3 标本采集与处理

2.3.4 指标检测及方法

2.3.5 统计学处理

2.4 结果

2.4.1 一般状况观察

2.4.2 血清睾酮含量测定结果

2.4.3 大鼠睾丸指数的变化

2.4.4 睾丸组织形态学观察

2.4.5 精子质膜完整性观察结果

2.4.6 精子线粒体功能检测结果

2.4.7 精子DNA完整性观察结果

第3章 讨论与结论

3.1 讨论

3.2 结论

3.2.1 何首乌饮对衰老大鼠的睾酮的影响

3.2.2 何首乌饮对衰老大鼠睾丸指数、睾丸结构的影响

3.2.3 何首乌饮对衰老大鼠精子质膜完整性的影响

3.2.4 何首乌饮对衰老大鼠精子线粒体功能的影响

3.2.5 何首乌饮对衰老大鼠精子DNA完整性的影响

参考文献

附录

致谢