中华绒螯蟹组蛋白基因的克隆及其在精子发生中的变化特征

摘要

在大多数动物的精子发生过程中，与DNA结合的碱性蛋白会逐渐发生变化，体细胞的组蛋白会被一种过渡蛋白替代，随后被碱性更强的鱼精蛋白替代，随着替代的蛋白碱性越来越强，精子核被一步步浓缩成了致密的结构。中华绒螯蟹，又称毛蟹、河蟹，在分类地位上隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、方蟹科、绒螯蟹属。此类动物的精子无鞭毛，由一个呈酒杯状的细胞核包裹着一个球形的顶体构成。一个有趣的现象是此类动物的精子核缺少致密的染色质，其精子为非浓缩核，但是其形成机制尚不是很清楚。
　　为了研究组蛋白在中华绒螯蟹精子发生中的变化特征，本文首先通过 PCR的方法克隆出四种组蛋白H2A、H2B、H3和H4的编码区基因，其中H2B的编码区长369 bp，编码123个氨基酸，预测分子量大小为13.6 Ku，H2A的编码区包含369 bp的碱基，编码123个氨基酸，预测分子量为13.1 Ku，H3的编码区包含408 bp的碱基，编码136个氨基酸，预测分子量为15.3 Ku，H4的编码区为309 bp，编码103个氨基酸，预测分子量为11.3 ku。随后构建了相应的原核表达载体 pET-30a-H2B、pET-30a-H2A、pET-30a-H3和pET-30a-H4，之后分别转化大肠杆（Escherichia coli）Rosetta（DE3）感受态细胞中，经过异丙基β-D硫代半乳糖苷酶（IPTG）诱导成功表达出相应的重组蛋白；利用 NIA-琼脂糖凝胶柱来纯化重组蛋白，免疫新西兰大白兔（ Oryctolagus cuniculus），制备了H2A和H2B的多克隆抗体。
　　其次，通过免疫荧光和免疫电镜技术来检测四种组蛋白H2B、H2A、H3和H4在中华绒螯蟹精子发生中的变化，得到以下实验结果：
　　1.组蛋白H2B在精原细胞、精母细胞、早期精细胞及其变态中期精细胞的核内一直存在，在精细胞变态晚期，组蛋白 H2B有一部分从细胞核转移到了顶体囊中。在成熟的精子中，组蛋白H2B主要存在于顶体囊中。
　　2.组蛋白 H3在中华绒螯蟹的整个精子发生过程中一直存在于生殖细胞包括成熟精子的核内，并没有发生抛弃和转移。
　　3.组蛋白 H4在精原细胞、精母细胞、精细胞及其变态中的精细胞和成熟的精子的核内一直存在，没有发生向核外或者顶体囊的转移。
　　4.组蛋白H2A在精原细胞、精母细胞、精细胞的细胞核和细胞质中存在，在成熟的精子中，主要存在于顶体囊和核杯内侧。
　　通过以上的实验结果，我们推测中华绒螯蟹成熟精子核内组蛋白H3和H4的保留以及精子形成过程中H2B和H2A向顶体囊的转移与其非浓缩核有一定的关系。

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第1章 绪 论

1.1 精子发生及与其相关的核碱性蛋白

1.2 十足目非浓缩核的精子核及其碱性蛋白

1.3 中华绒螯蟹的雄性生殖系统

1.4 研究目的及意义

第2章 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.2 主要实验仪器

2.3 主要实验药品及配方

2.4 试验技术

第3章 中华绒螯蟹组蛋白H2B、H2A、H3和H4的基因克隆、原核表达及抗体制备

3.1 组蛋白H2B的基因克隆，原核表达及抗体制备

3.2 组蛋白H2A的基因克隆，原核表达及抗体制备

3.3 组蛋白H3的基因克隆及原核表达

3.4 组蛋白H4的基因的克隆及原核表达

3.5 讨论

第4章 中华绒螯蟹四种组蛋白H2B、H2A、H3 和H4在精子发生中的变化

4.1 精巢的组织切片

4.2 组蛋白H3和H4在精子发生中的变化特征

4.3 组蛋白H2B在精子发生中的变化特征

4.4 组蛋白H2A 在精子发生中的变化特征

4.5 讨论

结论

参考文献

致谢

攻读博士期间取得的科研成果