表观遗传基因对衰老大鼠睾丸组织退行性变的作用及何首乌饮干预机制

摘要

目的：
　　探讨表观遗传基因对衰老大鼠睾丸组织退行性变的作用及何首乌饮干预机制。
　　方法：
　　1.Wistar雄性大鼠60只，随机分为六组：青年对照组、自然衰老组、何首乌饮组、何首乌组、肉苁蓉组、怀牛膝组，每组10只。其中青年对照组于12月龄处死取材；何首乌饮组、何首乌组、肉苁蓉组和怀牛膝组从16月龄开始分别灌胃何首乌饮、何首乌提取液、肉苁蓉提取液和怀牛膝提取液，自然衰老组灌胃等量生理盐水，连续60 d。取青年对照组、自然衰老组和何首乌饮组大鼠睾丸组织适量进行DNA甲基化芯片检测，筛选甲基化差异基因，并进行相关生物信息学分析。
　　2.采用甲基化特异性PCR（MSP）技术检测青年对照组、自然衰老组、何首乌饮组、何首乌组、肉苁蓉组及怀牛膝组睾丸组织表观遗传基因AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的甲基化水平。
　　3.采用荧光定量PCR技术检测青年对照组、自然衰老组、何首乌饮组、何首乌组、肉苁蓉组及怀牛膝组睾丸组织表观遗传基因AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的mRNA表达水平。
　　4.采用免疫荧光染色技术观察青年对照组、自然衰老组、何首乌饮组、何首乌组、肉苁蓉组及怀牛膝组睾丸组织溴脱氧尿嘧啶核苷（Bromodeoxyuridine，BrdU）的表达情况。
　　结果：
　　1.甲基化芯片筛选结果甲基化芯片共筛选出青年对照组和自然衰老组的差异甲基化基因共1728个，其中受何首乌饮直接调控的差异甲基化基因有238个。自然衰老组1176个基因的甲基化水平较青年对照组升高，何首乌饮用药后使其中135个基因甲基化水平下降；自然衰老组552个基因甲基化水平较青年对照组降低，何首乌饮用药后，使其中103个基因甲基化水平增加。通过GO分析和Pathway分析显示，这238个基因分布于23条信号通路上，这些信号通路与疾病、细胞增殖和凋亡、细胞粘附等有关。
　　2.MSP技术检测AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的甲基化水平 MSP检测结果发现，与自然衰老组比较，青年对照组、何首乌饮组、何首乌组、肉苁蓉组、怀牛膝组AXL、wnt2b、MAPK10甲基化百分比明显升高（P<0.05），其中肉苁蓉组、怀牛膝组甲基化百分比明显低于何首乌饮组（P<0.05），何首乌组与何首乌饮组间差异无统计学意义（P>0.05）；C-myb、Ttc29甲基化百分比明显降低（P<0.05），其中，何首乌组、肉苁蓉组、怀牛膝组甲基化百分比较何首乌饮组明显升高（P<0.05），青年对照组与何首乌饮组间差异无统计学意义（P>0.05）。
　　3.qRT-PCR技术检测AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的mRNA表达水平qRT-PCR技术检测结果发现，与自然衰老组比较，青年对照组、何首乌饮组、何首乌组、肉苁蓉组、怀牛膝组wnt2b、MAPK10表达水平均明显降低（P<0.05），AXL、Ttc29、C-myb表达水平均明显升高（P<0.05）；和何首乌饮组比较，怀牛膝组Wnt2b表达水平明显升高（P<0.05），AXL、Ttc29、C-myb表达水平明显下降（P<0.05），青年对照组与何首乌饮组间差异无统计学意义（P>0.05）。
　　4.BrdU染色结果利用免疫荧光染色技术发现，BrdU阳性产物呈红色斑块状或颗粒状，位于细胞核内。各组的BrdU阳性细胞均位于生精小管基膜附近的精原细胞内。统计分析表明，和自然衰老组比较，青年对照组、何首乌饮组、何首乌组、肉苁蓉组、怀牛膝组生精小管内阳性细胞数明显增加（P<0.05）；何首乌组、肉苁蓉组、怀牛膝组阳性细胞数明显低于何首乌饮组（P<0.05），且三组间差异无统计学意义（P>0.05）。
　　结论：
　　1.青年对照组和自然衰老组共有1728个差异甲基化基因，其中238个差异甲基化基因受何首乌饮直接调控。这238个基因分布于与疾病、细胞增殖和凋亡、细胞粘附等有关的23条信号通路上。
　　2.何首乌饮、何首乌提取液、肉苁蓉提取液、怀牛膝提取液组均可以提高wnt2b、MAPK10和AXL的启动子甲基化水平，下调wnt2b、MAPK10基因 mRNA的表达；同时，降低Ttc29和C-myb的启动子甲基化水平，上调Ttc29、C-myb和AXL基因mRNA的表达；其中何首乌饮的效果最好，何首乌提取液好于肉苁蓉提取液和怀牛膝提取液。
　　3.何首乌饮、何首乌提取液、肉苁蓉提取液、怀牛膝提取液组均能促进自然衰老大鼠睾丸组织精原细胞的增殖，且何首乌饮组的效果强于三个单味药组。

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第1章 综述

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 药物制备

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 动物分组及给药

2.2.2 取材

2.2.3 甲基化芯片检测与数据分析

2.2.4 甲基化特异性PCR

2.2.5 实时荧光定量PCR

2.2.6 免疫荧光染色

2.2.7 统计分析

2.3 实验结果

2.3.1 基因芯片扫描图片

2.3.2 基因芯片筛选结果

2.3.3 MSP检测基因启动子区DNA甲基化变化

2.3.4 qRT-PCR检测各基因mRNA水平的变化

2.3.5 相关性分析

2.3.6 BrdU染色

2.4 讨论

2.5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间取得的学术成果