黑骨藤指纹图谱及谱效关系探索性研究

摘要

苗药黑骨藤为萝藦科（Asclepiadaceae）杠柳属（Periploca）植物黑龙骨（Periploca forrestii Schltr.）的根茎或全株植物，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003年版，具有活血、通经、解毒、祛风等功效，用于治疗类风湿关节炎、跌打损伤、月经不调等疾病。主要分布于我国西部、南部及西南地区，如贵州、广西、四川、青海、西藏等地。
　　目前，黑骨藤的基础研究非常薄弱，现行质量标准中仅有性状、理化鉴别，缺乏专属可靠的质量控制方法，其发挥功效的药效物质基础尚不明确，质量控制方法和技术手段落后，与其日益广泛的应用相脱离，严重制约了黑骨藤的深度开发与利用。鉴于目前的状况，为了更好地对黑骨藤药材进行品质评价，促进黑骨藤药材的深度开发与利用，本课题以贵州特色苗药材黑骨藤为研究对象，采用现代分析评价手段对黑骨藤药材的质量评价模式进行探索性研究，结合现代色谱光谱技术，以及生物学手段，开展化学指纹图谱、生物活性以及基于“谱-效”关系的有效物质初步辨识研究，以期在药效物质辨识和质量控制模式方面获得新的发展。研究结果将为黑骨藤药材的质量控制、进一步开发与利用提供科学依据和技术支撑。
　　第一部分黑骨藤指纹图谱研究
　　课题组前期对黑骨藤药材抗类风湿关节炎开展了大量基础性研究工作，明确了其抗类风湿关节炎的生物活性部位。本课题采用高效液相色谱法，对课题组前期研究发现的黑骨藤药材抗类风湿关节炎活性部位（80％乙醇提取物）进行指纹图谱测定方法建立研究，并在《中国药典》2015年版附录相关方法学验证指导原则下进行了方法学验证。在此基础上，对12批不同产地黑骨藤的80%乙醇提取物进行指纹图谱测定，使用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版进行相似度评价。此外，对这12批黑骨藤80%乙醇提取物共有峰峰面积数据处理，并应用数理统计软件 SPSS对12批黑骨藤进行聚类分析，分析结果表明，产地相近的药材基本上划归为一类，这些统计结果表明黑骨藤提取物的质量与其生长环境很可能有较大关联性。
　　第二部分黑骨藤药材生物活性研究
　　对12批不同产地黑骨藤的80%乙醇提取物进行了抗类风湿性关节炎药理实验，实验中采用了弗氏完全佐剂造模大鼠抗类风湿关节炎（AA）模型，以大鼠足踝关节原发性肿胀直径、大鼠对侧踝关节继发性炎症直径、大鼠的体重、胸腺、脾、肾上腺、踝关节浸出液（肾上腺前列腺素PGE2）为测定指标，观察不同产地的黑骨藤对致病大鼠的影响。造模后给药组与空白组、模型组比较均有明显变化（P<0.05），原发性关节炎前期低剂量组均呈现出一定的抑制肿胀作用，高剂量组中相思河、荔波、黔陶产地的黑骨藤提取物药效作用最为明显。原发性关节炎后期，低剂量组的情人谷、香纸沟、相思河抑制肿胀较为明显，高剂量组中相思河产地黑骨藤有较明显的抗肿胀效果。各大鼠继发型关节炎肿胀不太明显，继发性反应前期，低剂量组中香纸沟、荔波、花溪、黔陶产地的黑骨藤抗类风湿关节炎较为明显，高剂量组中相思河、荔波、花溪产地的黑骨藤效果明显。在实验末期阶段，高、低剂量中除相思河、荔波、花溪产地的黑骨藤药效效果明显外，高坡产地的抗炎效果也明显增强。低剂量组中，情人谷、香纸沟、相思河产地组的关节浸出液PGE2含量明显减少。高剂量组中，情人谷、香纸沟、玉林、相思河、开阳、桂林产地组的关节浸出液PGE2含量明显减少。
　　第三部分黑骨藤谱效关系研究
　　在黑骨藤药材提取物指纹图谱和抗类风湿关节炎模型药理数据的研究基础上，使用灰色关联度分析方法对12批不同产地的黑骨藤指纹图谱与药效的关联性进行分析，研究黑骨藤的80%乙醇提取物各主要色谱峰对抗类风湿关节炎的药效贡献大小。分析结果显示，12批黑骨藤的80%乙醇提取物有10个共有峰，按关联度大小排序为A2、A10、A8、A1、A4、A6、A7、A5、A3、A9，色谱峰A2、A10、A8号与类风湿关节炎的药效关联性最大，可能是黑骨藤提取物抗类风类关节炎作用的有效成分，通过黑骨藤指纹图谱色谱峰的指认，知 A2号色谱峰为绿原酸。
　　第四部分黑骨藤总多酚提取工艺
　　采用超声辅助提取方法和透明质酸酶分解透明质酸钠模型，以总多酚提取率与其抗过敏活性为综合评价指标，在单因素试验的基础上，进一步使用响应面法优化，对黑骨藤中总多酚提取工艺进行了研究。最终得到黑骨藤中总多酚的最佳提取工艺参数为：乙醇溶剂浓度为57.33%，超声时间为33.33 min,溶剂用量为16.11 mL·g-1。在此提取条件下，黑骨藤中总多酚提取率为60.30±0.10 mg·g-1，黑骨藤总多酚抗过敏IC50为32.64±0.09μg·mL-1，结果提示黑骨藤总多酚具有良好的抗过敏效果。

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本文所用仪器说明

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序言

第一章 综述

1.1 黑骨藤性状鉴别

1.2 黑骨藤化学成分研究进展

1.3 黑骨藤植物药理作用研究进展

1.4 大鼠佐剂型关节炎模型

1.5 胶原诱导性关节炎模型

1.6 其它关节炎模型

1.7 中药质量控制

1.8 中药谱效关系

1.9 本章小结

第二章 黑骨藤抗类风湿性关节炎部位HPLC指纹图谱研究

2.1 黑骨藤抗类风湿关节炎部位HPLC指纹图谱测定条件的优化研究

2.2 方法学考察

2.3 黑骨藤抗类风湿关节炎部位HPLC指纹图谱的建立

2.4 黑骨藤药材抗类风湿关节炎部位指纹图谱聚类分析

2.5 黑骨藤药材抗类风湿关节炎部位指纹图谱主成分因子分析

2.6 本章小结

第三章 黑骨藤抗类风湿关节炎药理实验

3.1 实验仪器

3.2 实验试剂

3.3 实验动物

3.4 供试药材的制备与给药方法

3.5 试验方法

3.6 实验结果

3.7 本章小结

第四章 黑骨藤抗类风湿关节炎谱效关系研究

4.1 灰色关联度分析方法应用

4.2 12批不同产地黑骨藤药材谱效相关性分析

4.3 分析与讨论

4.4 本章小结

第五章 黑骨藤多酚物质提取工艺研究

5.1 实验仪器及试剂

5.2 实验方法

5.3 统计处理方法

5.4 结果与讨论

5.5 本章小结

第六章 结论与展望

6.1 实验结论

6.2 展望

参考文献

致谢

附录

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