杀蚜蝉拟青霉菌株筛选、培养及其致病作用研究

摘要

本文以蚜虫为试虫，从不同来源的蝉拟青霉菌株中筛选出对中药材板蓝根蚜虫(Lipaphis erysimi)具有较高致病性的LB菌株，并系统研究其对蚜虫的入侵和致病过程、对蚜虫的致病性及其影响因子、生物学特性、液体及固体培养条件优化、粗毒素杀蚜活性及常用化学农药与该菌的相容性等内容。本研究旨在探索适合蝉拟青霉生物学特性的基本培养方法与技术，揭示其对蚜虫的致病机理及控制潜能，明确蝉拟青霉对蚜虫的相互作用关系，为蚜虫综合治理中有效利用蝉拟青霉提供理论依据，同时也为寄主与病原物互作关系的研究提供新的例证。结果如下： 1、菌株筛选。以不同昆虫寄主采集的拟青霉(Paecilomyces)和白僵菌(Beauveria)菌株对白术蚜虫(Macrosiphum sp.)进行生物测定。结果表明，不同属种的真菌菌株的致病性存在差异，其中蝉拟青霉的几个菌株表现了较强的致病力。进一步对12株蝉拟青霉菌株培养特性及其对蚜虫的致病性进行测定，结果表明不同菌株的培养特性和致病力存在差异，其中以蝉拟青霉LB菌株的致病力强、培养特性优良，对蚜虫的校正死亡率为80.97％，致死中时LT50为4.44d，致死中浓度LC50为0.87×106孢子/mL。 2、致病机理研究。通过扫描电镜观察，蝉拟青霉分生孢子在蚜虫体表萌发、形成芽管后可产生附着胞或直接侵入表皮，昆虫节间膜等薄弱处也是其侵染的主要部分，随后菌丝在昆虫体内形成，如湿度足够高，菌丝穿出体表产孢而再侵染新害虫。用明胶-琼脂平板法研究了蝉拟青霉12不同来源菌株的胞外蛋白酶产酶水平与其毒力的关系。结果表明，不同菌株的产酶水平存在差异，且产酶水平的高低与其对蚜虫的毒力存在显著性关系。因此可以认为该菌的胞外蛋白酶活力是构成毒力的主要因素之一。 3、生物学特性及其与致病性的关系。温度、pH、湿度对蝉拟青霉生长、产孢及孢子萌发具有明显的影响。蝉拟青霉LB菌株生长、产孢及孢子萌发的最适温度是25℃。pH6时菌落生长最快，分生孢子产生及萌发的最适值为pH6～7。光照对菌落生长、孢子萌发没有明显影响，对产孢量有促进作用。孢子萌发的相对湿度范围为RH90％～100％，最适湿度是RH100％。在20～30℃范围内，蝉拟青霉LB菌株对蚜虫有致病性，在25℃下毒力最强；不同温度和不同pn值下培养的蝉拟青霉产孢量有差别，但所获得的分生孢子在相同条件下对蚜虫的毒力没有差异。在RH90～100％范围内，蝉拟青霉LB菌株对蚜虫有致病性，在RH100％时毒力最强。温度、湿度对致病性有重要的影响，在温度、湿度的互作中，湿度更具有重要作用。 4、液体培养条件优化。通过对不同碳源、氮源、无机盐等对蝉拟青霉菌丝生长的影响研究，结果表明：葡糖糖为蝉拟青霉液体培养的最适碳源，蛋白胨为该菌生长的最适氮源，K2HPO4和MgSO4作为无机盐有利于菌丝生长。经正交试验筛选出的培养基为：葡萄糖3％，蛋白胨1.5％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.2％组合为优良的液体培养基。摇瓶发酵的适宜条件为：培养温度25～27℃，初始pH6～7，接种量6％，摇床转速为150r/min，500 mL三角瓶最适装液量为100 mL，发酵周期为7d。 5、液体发酵代谢特性。随培养时间的延长，培养液中的还原糖含量、氨基氮含量、酸碱度和菌丝生物量均发生明显的变化。接种培养48h内，菌丝产量增长较慢；培养48～144h，菌丝生物量增长幅度最大，接种168h，菌丝生物量达22.45 g/L。培养液的pH值、糖含量、氮含量随培养时间的延长逐渐降低，菌丝快速生长的时期是糖、氮消耗最大的时期；192h后培养终止时，发酵液中的还原糖还有25％尚未消耗，而氨基氮的含量约为60％；接种72h后营养液的pH值降为4.56，因此接种72小时后，可适当增加pH值，以利蝉拟青霉菌丝生长。 6、固体培养条件优化。经单因素、一般组合和正交试验筛选，得到其适宜的固态发酵培养基为玉米粉+麦麸+黄豆粉+米糠(6:4:1:1).培养条件筛选结果表明，该菌株固态发酵培养的优化条件为：接种量6％、料水比1:1.2、初始pH值6～7、培养温度24℃、发酵时间22d、培养基厚度在2cm左右、光照24h/d，添加ZnSO4或BaCl2有利于产孢。在此优化条件下固态发酵培养，其孢子产量稳定在45×108个/g以上，最高产孢量达到54.72×108个/g。 7、粗毒素杀蚜活性。发酵液对蚜虫的致死率达到81.11％，初步表明蝉拟青霉LB菌株液体培养能产生毒杀蚜虫的物质，而且杀虫活性较高。蚜虫对胞外粗毒素敏感，处理2d后的死亡率高，处理后蚜虫的死亡率随处理时间和浓度的提高而增加。胞内粗毒素提取物具有一定的杀蚜虫活性，但不及胞外粗毒素的效果明显。 8、化学农药与蝉拟青霉的相容性及增效性。不同的化学农药对蝉拟青霉菌丝生长、分生孢子萌发均有不同程度抑制作用。杀菌剂对菌丝生长、产孢、孢子萌发抑制作用大，杀虫剂相对较小。结果表明吡虫啉对菌丝生长抑制作用小，对孢子萌发无明显的影响，因此可以作为蝉拟青霉混用的首选药剂。该药剂与菌混用后具有明显的增效作用，菌孢子液与药(1:15000或1:30000)混用，致死中时LT50提前，蚜虫的校正死亡率提高。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.蚜虫的危害及防治

2蚜虫病原真菌资源

3杀蚜真菌的应用

4蝉拟青霉的研究应用概况

4.1蝉拟青霉的药理作用

4.2蝉拟青霉对害虫的致病性及在生防中的应用

第二章蝉拟青霉杀蚜优良菌株筛选

第一节不同属种昆虫病原真菌菌株筛选

1材料和方法

2结果与分析

3.讨论

第二节蝉拟青霉优良菌株筛选

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三章蝉拟青霉杀蚜机理研究

第一节蝉拟青霉对蚜虫侵染行为的初步研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

附图

第二节蝉拟青霉胞外蛋白酶与毒力的关系

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第四章蝉拟青霉生物学特性及其与毒力的关系

第一节蝉拟青霉生物学特性研究

1材料和方法

2结果和分析

3讨论

第二节蝉拟青霉致病性的影响因子

1材料与方法

2结果与分析

3.讨论

第五章蝉拟青霉营养需求及培养条件研究

第一节蝉拟青霉菌丝对不同碳、氮源及无机盐的利用研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第二节蝉拟青霉液体培养基筛选及培养条件优化

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三节蝉拟青霉液体培养特性研究

1材料与方法

2结果与分析

3.讨论

第四节蝉拟青霉固态培养基筛选及培养条件研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第六章蝉拟青霉粗毒素杀蚜活性研究

1材料与方法

2结果与分析

2.1发酵原液及菌丝体水溶液杀蚜虫作用

2.2代谢液粗毒素杀虫活性

2.3菌丝体粗毒素提取物丙酮溶液杀蚜活性

3讨论

第七章化学农药对蝉拟青霉的相容性及增效性研究

第一节不同化学农药对蝉拟青霉的影响

1材料与方法

2结果与分析

3.讨论

第二节吡虫啉对蝉拟青霉的影响及菌药混用研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第八章结论与讨论

致谢

参考文献

附录

图版