鼠源单克隆抗体犬源化的研究

摘要

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)为细小病毒科细小病毒属的成员,病毒粒子无囊膜,核衣壳为等轴对称的二十面体,对外界抵抗力强,CPV只有 CPV-2一个抗原型,该病传染性强,发病迅猛,病情严重,死亡率高,犬之间通过直接或间接接触而传播该病?发病犬有两种表现型:心肌炎型与肠炎型?肠炎型以严重的呕吐与严重的出血性腹泻为主;心肌炎型以幼犬呼吸与心血管的衰竭为主要特征?犬细小病毒病治疗尚无特效药物,临床治疗时采用对症治疗?支持疗法和特异性疗法结合应用?其中特异性疗法主要采用注射高免血清和单克隆抗体进行治疗,在 CPV感染早期,单克隆抗体治疗效果显著,然而鼠源单克隆抗体的异源性在临床治疗引起宿主免疫反应,使单抗疗效降低,甚至诱发严重的免疫反应?因此有必要对其进行改造，为此本研究首先建立了检测犬免疫球蛋白G(IgG)的双夹心ELISA方法,而后构建嵌合抗体全长基因质粒并在哺乳动物细胞表达,为后期建立稳定表达犬-鼠嵌合抗体细胞系奠定基础，为以后开发犬细小病毒病抗体药物治疗提供支持。
　　本研究以兔抗犬 IgG Fc段多克隆抗体为包被抗体,过氧化酶标记的兔抗犬IgG(全分子)多克隆抗体为检测抗体,建立了双抗体夹心 ELISA定量检测方法,并采用Protein A方法从犬血清中纯化犬IgG作为ELISA检测标准品?该检测方法与小鼠?兔?马?牛?鸡及羊常见动物血清无交叉反应,特异性好;最低检测下限可以达到4.8 ng/mL,敏感性较高?目的在于提供一种检测犬IgG的检测方法以及便于后期检测犬-鼠嵌合抗体的表达和筛选稳定表达犬-鼠嵌合抗体的细胞系?
　　本研究成功从杂交瘤细胞扩增了抗体重链轻链可变区,经 IMGT网站分析所扩增的序列具有抗体功能,从犬外周血单个核细胞(PBMC)中扩增了犬IgG重链轻链恒定区,经NCBI进行Blast分析与犬IgG重链轻链基因同源性均在99％以上,并通过重叠延伸PCR成功拼接为嵌合序列,定向克隆至pcDNA3.1(+)载体上,重组质粒转染 CHO细胞后,经 ELISA检测成功表达,并纯化了嵌合抗体,本研究为犬-鼠嵌合重组抗体表达方法的建立提供了实验支持,也为今后下一步鉴定抗体效力和功能以及建立稳转细胞系奠定了一定的物质基础。

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缩略词

第一章 前言

1.1犬细小病毒的研究进展

2.1单克隆抗体药物的研究进展

3.1重组抗体技术的研究进展

4.1本研究的目的与意义

第二章 检测犬免疫球蛋白G的夹心ELISA方法的建立

2.1 材料与设备

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

第三章 嵌合抗体重链?轻链全长基因的扩增与重组质粒的构建

3.1 材料与设备

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 嵌合抗体的表达与纯化

4.1材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

附 录Ⅰ