补阳还五汤联合MSCs移植对大鼠脑缺血再灌注损伤模型VEGF和Ki-67表达的影响

摘要

目的：采用 Zea-Longa 线栓法并加以改进建立局灶性脑缺血再灌注模型,从颈动脉注入骨髓间充质干细胞(MSCs),并给予补阳还五汤,应用免疫组化染色法观察大鼠缺血再灌注模型缺血侧血管内皮生长因子(VEGF)和增值细胞核抗原(Ki-67)的表达。来评价补阳还五汤联合MSCs移植对修复脑缺血再灌注损伤模型大鼠血管及病变组织的作用,来探讨补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对脑缺血损伤的神经保护机制。
　　方法：清洁级成年健康 SD 大鼠,无菌条件下取出股骨和胫骨,DMEM 培养液冲出骨髓,200 目钢网过滤。然后用密度梯度离心法分离获取骨髓单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),PBS洗两次,将沉淀物加入含10%FBS的DMEM培养液 10ml,轻轻吹打,做成细胞悬液,计数,稀释,按设计密度接种于 T-75培养瓶中,置于37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中原代培养。待细胞铺满瓶底后用 25%胰蛋白酶消化传代,取第七代冻存移植。
　　采用“线栓法”制备 SD 大鼠短暂性脑缺血再灌注损伤模型,模型分为空白组、对照组、MSCs移植治疗组和益气活血方联合MSCs移植治疗组,每组15只。在造模缺血2小时再灌注1天后,取各组造模成功的不同给药：益气活血方联合MSCs 移植治疗组和 MSCs 移植治疗组经颈动脉注入 MSCs 悬液,空白组、对照组经颈动脉注入等量生理盐水。脑缺血模型空白组、对照组和 MSCs移植组分别灌胃生理盐水(15ml/kg体重),联合组按同等的相应药量灌服益气活血汤药。各组在造模前3天开始给药,每日一次,连用7天。结束后断头取脑,取缺血再灌注损伤病灶处脑组织放入固定液中固定1h,脱水、透明、浸蜡,在海马周围连续制作脑部冠状切片。
　　应用 HE 染色观察细胞结构及形态；应用免疫组化染色法识别血管内皮生长因子(VEGF)和增值细胞核抗原(Ki-67)的表达,光镜下记数。
　　结果：
　　1. HE 染色结果：假手术组神经细胞结构形态正常,核呈圆形或椭圆形,核和核仁明显,胞浆无红染,无细胞及间质水肿；模型组和移植组镜下见大量神经细胞变性、坏死、胞体皱缩,核固缩、碎裂、溶解,胞浆浓缩红染,间质水肿明显,炎症细胞浸润；联合组神经细胞变性、坏死数量减少与程度明显减轻。
　　2. 空白组脑组织中VEGF几乎不表达,对照组、MSCs移植治疗组和益气活血方联合MSCs治疗组与空白组相比,数目明显增多,尤以益气活血方联合MSCs治疗组表达最强。MSCs移植治疗组与对照比较P<0.05,益气活血方联合MSCs 治疗组与对照组比较 P<0.01；益气活血方联合 MSCs 治疗组与 MSCs 移植治疗组比较P<0.05。
　　3. 空白组脑组织中 Ki-67几乎不表达,对照组、MSCs 移植治疗组和益气活血方联合 MSCs 治疗组均可见到 Ki-67 表达,MSCs 移植治疗组与对照组比较 P<0.05,益气活血方联合 MSCs 治疗组与对照组比较 P<0.01；益气活血方联合MSCs治疗组与MSCs移植治疗组比较P<0.05。
　　结论：
　　1. 采用密度梯度离心法获取骨髓间充质干细胞( MSCs),将细胞经过传代培养使细胞得到扩增和纯化的MSCs。
　　2. 短暂性脑缺血再灌注损伤动物模型的制备采用改良线栓法取得了较好效果,神经行为学评分理想,症状很接近人表现。其简便、易行,容易操作,很具有实用性,是制作脑缺血再灌注损伤动物模型理想的方法。
　　3. 应用免疫组化染色法证明了益气活血方联合 MSCs 移植治疗短暂性脑缺血再灌注损伤可能通过诱发促进脑内 VEGF和 Ki-67的高水平表达,激活内源性神经保护机制,使它在保护病灶周围神经元、促进细胞增殖和组织修复中可能发挥着重要作用。

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前言

材料与方法

1 主要实验材料

2 实验方法

3.统计学分析

结果

1. MSCS细胞的成功制备

2. SD大鼠脑缺血再灌注损伤模型的成功制备

3. SD大鼠脑缺血再灌注损伤模型的神经功能缺损评分

4.病理形态学观察结果

讨论

1. 中医对短暂性脑缺血的认识

2.关于大鼠血再灌注模型的评价

3.补阳还五汤作用机制的探讨：

4.MCSs对脑缺血再灌注损伤的作用机理

5.脑缺血/再灌注损伤与VEGF和Ki-67表达

结论

致谢

参考文献

附录1 文献综述

1.VEGF的概述

2.VEGF在脑缺血时的表达

3.Ki-67发现结构、分布与功能

4. MSCs移植脑缺血损伤组织中VEGF的表达

5. 中医药治疗脑缺血损伤中的研究进展

6. 展望