转Bt-pta基因水稻后代分子检测与抗虫性鉴定

摘要

水稻是世界上最重要粮食作物之一，世界上近半数人口以稻米为食。一直以来，虫害是危害水稻产量的重要因素之一，而利用转基因技术培育抗虫水稻，可以有效解决这个问题。本研究以优良水稻恢复系辐恢838为受体材料，采用农杆菌介导法，将重组表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta转入其中，通过报告基因GUS表达检测，目的基因PCR检测，筛选出阳性T0代转基因水稻；将其收获后种植，对其进行报告基因GUS表达检测，及目的基因PCR检测，检测出T1代双价转基因水稻，对其进行抗虫性鉴定；将抗虫效果较好的双价转基因水稻收获后种下，得到T2代转基因水稻，每个株系取10株，对目的基因进行PCR检测，获得纯合的双价抗虫转基因水稻。
　　本论文获得的具体结果如下：
　　1.构建双价植物表达载体：首先构建中间载体，用HindⅢ和SpeI分别对基础表达载体pCAMBIA1301和质粒pUC57-Bt进行双酶切，回收目的基因Bt和载体骨架pCAMBIA1301，然后通过T4 DNA连接酶将目的基因连接到载体骨架上，构建中间载体pCAMBIA1301-Bt；然后用HindⅢ分别酶切pCU57-pta与中间载体pCAMBIA1301-Bt，回收目的基因与中间载体骨架，再用T4 DNA连接酶将目的基因pta连接到中间载体骨架上，成功构建植物表达质粒pCAMBIA1301-Bt-pta。
　　2. T0代转基因水稻的获得及初步检测：用农杆菌介导法将双价植物表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta转化优良水稻恢复系辐恢838，经驯化后移栽共获得105株再生植株，经过GUS化学组织染色及PCR检测，最终得到3个T0代转双价基因阳性转化子。
　　3. T1代转基因水稻的分子检测及抗虫性鉴定：将分单株收获的T0代转基因水稻种子种下，得到T1代转基因水稻株系，检测其报告基因GUS表达水平，并对初步检测出的阳性植株进行目的基因PCR检测、Bt毒蛋白表达酶联免疫检测以及室内和室外的抗虫性检测，共检测出29株抗虫效果较好的双价转基因水稻，并对其农艺性状进行考察。
　　4. T2代纯合双价转基因水稻的获得：分单株收获T1代29株抗虫效果较好的双价转基因水稻，种植获得29个株系，每个株系随机取10株，PCR法检测目的基因，10株全含目的基因的株系共29个，该29株系即为目的基因纯合株系，为以后组配杂交组合，获得抗虫杂交水稻提供恢复系材料。

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中文摘要

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英文缩略词与英汉对照

第一章 前言

1 文献综述

1.1 双价转基因水稻的研究进展

1.2 转基因植株的检测

2 本研究的目的、意义以及主要研究内容

2.1 研究目的和意义

2.2 研究的主要内容

第二章 T0代转基因水稻植株的转化及初步筛选

1 材料

1.1 供试水稻品种

1.2 菌株和质粒

1.3 主要试剂及引物

1.4 主要仪器

1.5 主要溶液配方

2 方法

2.1 双价载体pCAMBIA1301-Bt-pta的构建

2.2 农杆菌介导的水稻遗传转化

2.3 转基因水稻再生植株炼苗及移栽

2.4 转Bt-pta水稻再生植株检测

3 结果与分析

3.1 重组表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta的构建

3.2 再生植株的获得

3.3 转Bt-pta基因水稻再生植株鉴定

4 讨论

4.1 关于双价转基因抗虫水稻的获得

4.2 关于双价转基因抗虫水稻的抗虫性鉴定

第三章 T1代和T2代转基因水稻的分子检测及抗虫性鉴定

1 材料

1.1 水稻材料

1.2 质粒

1.3 主要试剂及引物

1.4 主要仪器

1.5 主要试剂配方

1.6 供试昆虫

2 方法

2.1 T1代转基因水稻的分子检测

2.2 T1代转基因水稻抗虫性鉴定

2.3 T1代转基因水稻主要农艺性状的考察

2.4 T2代转基因水稻的分子检测

3 结果与分析

3.1 T1转基因水稻的分子检测

3.2 T1代转基因水稻中Bt毒蛋白的含量与其抗虫性的关系

3.3 T1代转基因水稻的抗虫性鉴定

3.4 T1代转基因水稻的农艺性状的考察

3.5 T2代转基因水稻的分子检测

4 讨论

4.1关于高抗性、稳定遗传的双价转基因水稻的获得

4.2 关于双价转基因水稻农艺性状的改变

第四章 结论与展望

1 结论

2 创新点

3 展望

致谢

参考文献

附录一

附录二