兰科几种珍稀药用植物的丛生芽诱导研究

摘要

本研究以兰科几种珍稀药用植物（杜鹃兰、金钗石斛、白及）为试验材料，研究其丛生芽发生的影响因素和诱导途径，在成功建立了这几种植物丛生芽化学诱导方法的基础上，也对其丛生芽的转基因诱导进行了探索。主要研究结果如下：
　　1、以杜鹃兰种子无菌萌发的原球茎为试材，研究不同培养基、不同种类及浓度的植物生长调节物质、不同浓度活性炭及不同培养条件对杜鹃兰原球茎增殖的影响。结果表明：以1/2MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA1.0 mg·L-1+活性炭0.5 g·L-1为增殖培养基，温度15℃，光照强度2000 lx时有利于杜鹃兰原球茎的增殖，增殖的原球茎呈丛生型且长势较好，40 d内增殖率可达177.11%；以生长势好的增殖原球茎为试验材料，研究不同含量的大量元素、不同种类及浓度的植物生长调节物质、活性炭及正交优化试验（TDZ、IAA、蔗糖、大量元素）对杜鹃兰“芽丛”诱导增殖的影响。结果表明：1/4MS培养基附加TDZ1.5 mg·L-1+IAA0.4 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1为杜鹃兰“芽丛”诱导增殖的适宜培养基，最大增殖系数达3.16。
　　2、以金钗石斛种子为试材，通过正交试验研究75%乙醇处理时间、0.1%升汞处理时间、6-BA、NAA对金钗石斛种子萌发的影响。结果表明：种子分别经75%乙醇处理15 s、0.1%升汞处理10 min后，接种到不添加6-BA和NAA的MS培养基中进行萌发，得到的萌发率高；以大小相近、深绿色的原球茎为试验材料，MS+蔗糖30 g·L-1为基本培养基，采用正交试验研究6-BA、2,4-D和活性炭对金钗石斛愈伤组织诱导增殖的影响。结果表明：添加6-BA1.0 mg·L-1、2,4-D1.0 mg·L-1和活性炭0.2 g·L-1的培养基对愈伤组织的诱导增殖效果较好，诱导出的愈伤组织呈绿色且长势较好；以绿色愈伤组织为试验材料诱导丛生芽，MS+蔗糖30 g·L-1为基本培养基，采用正交试验研究6-BA、NAA和活性炭对金钗石斛丛生芽诱导的影响。结果表明：培养基中添加6-BA1.0 mg·L-1、NAA0.1 mg·L-1和活性炭0.2 g·L-1有利于金钗石斛丛生芽的诱导，诱导率可达80.0%。
　　3、以白及种子为试材，研究不同浓度的NAA对白及种子萌发的影响。结果表明：在MS+NAA0.5 mg·L-1+活性炭0.5 g·L-1+土豆泥75 g·L-1培养基中，种子的萌发率较高；以长势基本一致的幼苗为试验材料，研究不同浓度的6-BA对白及丛生芽诱导的影响。结果表明：3/4MS培养基附加6-BA0.1 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+IBA0.15 mg·L-1+活性炭0.3 g·L-1+香蕉汁50 g·L-1为白及丛生芽诱导的适宜培养基，诱导率可达87.5%。
　　4、以杜鹃兰、金钗石斛及白及原球茎为农杆菌遗传转化材料，研究了材料的生理状态、创伤方式、菌液OD600值、预培养时间、共培养时间、侵染时间对上述三种兰科药用植物遗传转化效率的影响。结果表明：少数杜鹃兰原球茎GUS染色呈蓝色，少数GUS染色呈蓝色的植株PCR检测呈阴性，即杜鹃兰遗传转化极其困难（试验效果不佳）；适于金钗石斛遗传转化的条件：以直径5 mm的金钗石斛原球茎为材料，预培养1 d后置于OD600为0.5～0.7的菌液中侵染10 min，期间用频率40 KHz的超声波处理3 min，共培养2 d，部分金钗石斛原球茎GUS染色呈蓝色，部分GUS染色呈蓝色的植株PCR检测呈阳性，初步证实 ipt基因已转入金钗石斛基因组中；适于白及遗传转化的条件：以叶长10 mm的白及幼苗为材料，预培养2 d后置于OD600为1.0～1.2的菌液中侵染10 min，期间用频率40 KHz的超声波处理3 min，共培养2 d，部分白及幼苗GUS染色呈蓝色，部分GUS染色呈蓝色的植株PCR检测呈阳性，初步证实ipt基因已转入白及基因组中。

目录

缩略词表

第一章 文献综述

1 兰科植物概述

2 兰科植物的药理作用

3 兰科植物的组织培养

3.1 兰科植物组织培养的研究进展

3.2 兰科植物丛生芽的化学诱导研究现状

4 兰科植物遗传转化研究现状

5 研究目的和意义

第二章 兰科几种珍稀药用植物丛生芽的化学诱导研究

第一节 杜鹃兰“丛生芽”的化学诱导

1 试验材料

2 试验设计

3 结果与分析

4 讨论

第二节 金钗石斛丛生芽的化学诱导

1 试验材料

2 试验设计

3 结果与分析

4 讨论

第三节 白及丛生芽的化学诱导

1 试验材料

2 试验设计

3 结果与分析

4 讨论

第三章 兰科几种珍稀药用植物丛生芽的转基因诱导研究

第一节 材料与设备

1 试验材料

2 试剂与仪器

3 常用培养基

第二节 试验设计

1 根癌农杆菌的培养

2 卡那霉素敏感性试验

3 遗传转化方法

4 不同因素对遗传转化的影响

5 GUS组织化学法检测

6 转化植株的PCR检测

7 数据统计及分析方法

1 杜鹃兰、金钗石斛和白及对Kan的敏感性

2 不同因素对遗传转化的影响

3 GUS组织化学检测

4 转基因植株的PCR检测

5 讨论

第四章 总结与展望

1 总结

1.1 杜鹃兰“芽丛”的化学诱导

1.2 金钗石斛丛生芽的化学诱导

1.3 白及丛生芽的化学诱导

1.4 兰科几种珍稀药用植物丛生芽的转基因诱导研究

2 本研究的创新之处

3 后续工作与展望

参考文献

致谢

附录

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