DKK1、DKK2基因多态性及甲基化对黔北麻羊生长性状的遗传效应分析

摘要

Wnt信号通路是一条存在于后生动物细胞内高度保守的关键信号通路，能调控动物机体多个生长发育阶段，Dickkopf（DKKs）家族作为Wnt信号转导途径主要的负调控因子，通过编码分泌型糖蛋白参与到Wnt通路级联反应，而Dickkopf1（DKK1）与Dickkopf2 （DKK2）是DKKs家族的重要成员，相关研究显示，DKK1基因能抑制成骨细胞分化，调控骨骼形成与骨再塑，是骨代谢的重要调控因子；DKK2基因能影响肢体骨骼与骨密度。据此，推测DKK1基因与DKK2基因的DNA遗传信息和表观遗传信息的改变，将会对山羊的生长性状产生直接或间接影响，因此，本研究从分子遗传与表观遗传两个角度，以黔北麻羊为实验材料，研究DKK1基因和DKK2基因SNP和DNA甲基化对生长性状的影响，筛寻显著影响山羊生长性状的SNP和DNA甲基化位点，期望为地方优良山羊品种的分子育种提供理论参考依据。 1. 黔北麻羊DKK1、DKK2基因SNPs与生长性状的相关性分析 通过构建DNA池结合直接测序方法检测了123只4~6月龄黔北麻羊（公羊59只，母羊64只）个体的DKK1、DKK2基因全部外显子和部分内含子的SNPs，DKK1基因筛选得到7个SNPs位点，分别为第一内含子C454T，第三外显子T1828C，第三内含子A1911G，第四外显子T2056C，第四外显子T2066C，第四外显子G2068A，第四外显子T2239C，其中第四外显子G2068A为错义突变，导致半胱氨酸（Cys）变为丝氨酸（Ser），其他外显子突变为同义突变；DKK2基因筛选得到一个 SNP位点——第四外显子C125904T，该位点突变并没有引起氨基酸编码的变化，为同义突变。 相关分析表明：DKK1基因第一内含子C454T位点雄性群体（♂）不同基因型与体重、体斜长、胸围差异显著（P＜0.05）；第三外显子T1828C位点雌性总群体不同基因型与体高、胸深差异显著（P＜0.05），雄性群体（♂）不同基因型与体重、体高差异显著（P＜0.05）；第三内含子A1911G位点雌性群体（♀）不同基因型与体斜长差异显著（P＜0.05）；第四外显子T2056C位点总群体、雄性群体（♂）、雌性群体（♀）三个群体中不同基因型与体重、体斜长、体高、胸围、胸深、胸宽、管围差异不显著（P＞0.05）；第四外显子T2066C位点雌性总群体不同基因型在体重、体斜长、胸深、胸围、管围差异显著（P＜0.05），雄性群体（♂）不同基因型与体高、体斜长、胸深、胸围、管围差异显著（P＜0.05）；第四外显子G2068A位点雌性总群体不同基因型与体重、胸深、胸围、管围差异显著（P＜0.05），雄性群体（♂）中不同基因型在体高、胸深、胸围、管围差异显著（P＜0.05）；第四外显子T2239C位点雌性总群体不同基因型与体重、体高、胸围差异显著（P＜0.05），雄性群体（♂）不同基因型与体高差异显著（P＜0.05），雌性群体（♀）不同基因型与体重、胸深、胸围差异显著（P＜0.05）。DKK2基因第四外显子C125904T雌性总群体、雄性群体（♂）、雌性群体（♀）三个群体中不同基因型与体重、体斜长、体高、胸围、胸深、胸宽、管围差异不显著（P＞0.05）。 2. 黔北麻羊DKK1、DKK2基因启动子甲基化对生长性状的遗传效应分析 采集50只周岁黔北麻羊公羊血样与生长性状数据，结合统计学软件进行筛选，分为高性状组（H）和低性状组（L），每组各3只，利用亚硫酸氢盐修饰后测序（BSP）等技术，探究了DKK1基因和DKK2基因高、低性状组间甲基化程度差异及各CpG岛甲基化状态与黔北麻羊生长性状之间的关系。研究结果表明：DKK1基因启动子区CpG岛的总体甲基化率在黔北麻羊高性状组（H）和低性状组（L）之间差异不显著（P＞0.05），两组之间DKK1基因启动子区CpG岛整体甲基化程度均较低，但高性状组（H）的总体甲基化率要低于低性状组（L）的总体甲基化率；DKK2基因启动子区CpG岛的总体甲基化率在黔北麻羊高性状组（H）和低性状组（L）之间差异显著（P＜0.05），高性状组（H）的整体甲基化率显著低于低性状组（L）整体甲基化率，其中目的CpG岛内第5、10、12个CG位点甲基化率在高低性状组间差异显著（P＜0.05），表明以上位点的甲基化状态可能对黔北麻羊体重、体斜长、体高、胸围、胸深、胸宽、管围有影响，可以尝试作为表观遗传标记辅助选择育种(epigenetics marker assisted-selection, eMAS)中提高黔北麻羊生长性状的有效表观遗传标记。

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2.1 实验材料

2.1.1 黔北麻羊血液采集与生长性状数据获取

2.1.2 实验所需仪器设备

2.1.3 实验所需试剂

2.2 实验方法

2.2.1 黔北麻羊基因组DNA的提取

2.2.2 黔北麻羊基因组DNA的检测

2.2.3 构建黔北麻羊品种DNA池

2.2.4 黔北麻羊DKK1、DKK2基因PCR扩增

2.2.4.1 引物设计及合成

2.3.3 黔北麻羊DKK1、DKK2基因多态性检测结果

2.3.3.1 构建DNA池初步筛选DKK1、DKK2基因多态性

2.3.3.2直接测序技术进一步筛选DKK1、DKK2基因SNPs位点