Vero细胞流感减毒活疫苗生产工艺的研究

摘要

现在市场上的流感疫苗主要为灭活病毒疫苗、减毒活病毒疫苗和重组HA疫苗这三种。流感病毒减毒活疫苗一般通过滴鼻接种，诱导粘膜免疫和细胞免疫等免疫反应，达到和自然感染过程同等的效果。 本研究以本实验室前期选育出的Vero细胞冷适应株A/Yunnan/1/2005Vca作为母本株，通过对培养过程中各个物理化学因素的探究来对流感病毒在Vero细胞上增殖的条件进行优化筛选，通过测定病毒收获液的TCID50及血凝效价等方式作为病毒产量指标，测定病毒产量。在国内外，细胞工厂培养技术已经是非常成熟和普遍的体外大量培养细胞的技术。使用细胞工厂来放大细胞及病毒的生产规模，可以为大规模生产搭建桥梁。本研究使用优化的条件将流感病毒放大至细胞工厂，来提高生产效率。本研究通过对Vero细胞为基质培养的流感病毒冷适应株收获液先后进行离心澄清、超滤浓缩、核酸酶处理以及柱层析等下游纯化工艺，来达到降低杂质、浓缩病毒、分离病毒与杂质的目的。本研究通过对两种层析纯化工艺进行对比，最终确定了使用Benzonase核酸酶以及Sepharose 4 Fast Flow对流感病毒进行层析纯化的工艺。最终病毒纯化液中Vero细胞残余DNA、牛血清白蛋白含量、蛋白含量等杂质均小于药典规定值，满足Vero细胞为基质制备疫苗的质量要求。 综上所述，本课题解决了流感病毒在Vero细胞上产量较低的问题，并确定了Vero细胞作为基质培养流感减毒冷适应株的最佳培养条件，使用了两步纯化方法用于Vero细胞流感病毒纯化，病毒回收率高，制备的流感灭活疫苗安全有效。

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摘 要

Abstract

第一章 流感病毒在Vero细胞上的适应性研究

前言

1.1实验材料

1.1.1病毒

1.1.2细胞

1.1.4仪器和设备

1.1.5主要溶液

1.2实验方法

1.2.1Vero细胞培养

1.2.2MDCK细胞培养

1.2.3病毒制备

1.2.4流感病毒培养

1.2.5血凝滴度的测定

1.2.6流感病毒半数感染量（TCID50）滴定

1.2.7探究各因素对流感病毒产量的影响

2培养条件优化结果

2.1病毒毒种TCID50滴定

2.2不同pH对流感病毒产量的影响

2.3不同血清浓度对流感病毒产量的影响

2.4不同TPCK胰酶终浓度对流感病毒产量的影响

2.5不同CPE对流感病毒产量的影响

2.6不同基础培养基对流感病毒产量的影响

2.7不同病毒吸附时间对流感病毒产量的影响

2.8不同病毒的感染复数（MOI）对流感病毒产量的影响

3在细胞工厂上的放大

3.1细胞工厂上放大Vero细胞

3.2细胞工厂上放大流感病毒

4结论

5讨论

6小结

第二章 Vero细胞培养的流感病毒的纯化处理

前言

7.1病毒

7.2层析填料

7.3仪器与设备

7.4主要试剂

7.5主要溶液

7.6耗材

8实验方法

8.1病毒液收获

8.2高速离心

8.3超滤膜孔径的筛选

8.4Benzonase核酸酶与分子筛过滤Sepharose 4FF联用

8.4.1Benzonase核酸酶处理

8.4.2Benzonase核酸酶的最适工作时间及浓度优化

8.4.3分子筛过滤Sepharose 4FF纯化

8.5分子筛过滤柱Sepharose 4FF与强阴离子交换柱Capto Q联用

8.6流感病毒纯化流程

9实验结果

9.1Benzonase核酸酶的最适工作时间及浓度优化

9.2超滤膜孔径的筛选结果

9.3两种纯化方式纯化结果的对比

10结果

10.1纯化工艺的确定

10.2纯化工艺环节中各项指标检测

11.1血凝效价

11.2血凝素含量

11.3残余宿主细胞（Vero）DNA的检测

11.4总蛋白含量

11.5感染性滴度

12讨论

13小结

全文小节

致谢

参考文献

附录Ⅰ 缩略语表

附录Ⅱ 基本实验操作

附录Ⅲ 溶液配制

原 创 性 声 明

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