贵州主栽草莓品种的离体快繁技术及组培苗的遗传变异

摘要

本文以‘章姬’和‘红颜’两个贵州主栽草莓品种为材料，对离体快繁技术、离体材料遗传变异的ISSR 及DNA甲基化检测等方面进行研究，旨在从遗传和表观遗传视角窥视遗传变异情况，为组培快繁生产草莓种苗提供决策依据。 1.优化了2个贵州主栽草莓品种的离体快繁技术体系 采用‘章姬’和‘红颜’2 个品种草莓的匍匐茎段为外植体，经过清水清洗和 0.1%升汞溶液消毒5~6 min，接种在MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L IBA+30.0 g蔗糖+7.0 g琼脂，诱导萌发。‘章姬’和‘红颜’草莓的最佳增殖培养基为：MS+0.5 mg/L BA+0.1 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖+7 g/L琼脂，pH(5.8~6.0)，‘章姬’的增殖系数为 4.9，‘红颜’的增殖系数为 1.9；‘章姬’的生根培养以1/2MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂最好，生根率均达90 %以上，而‘红颜’的最优生根基培养基为1/2MS+0.2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，生根率均达100%。二者在炼苗10 d后移栽至无菌基质中，其成活率达87%。 2.试管苗遗传稳定性的ISSR检测 选取长势一致的‘红颜’组培苗，检测继代次数(第0、5、7、9、10、12)的遗传变异情况。以‘章姬’组培苗为材料，检测继代次数(第0、5、7、9、10、12、14、18)的遗传变异情况。第0~12代由于材料限制，每代随机选取3株，第14代和18代每代随机选取20株，进行ISSR检测。结果表明，采用49个ISSR引物‘红颜’扩增出207个标记，‘章姬’扩增出214个标记。在引物检测范围内，所有条带均为单态带，因此在组培快繁过程中组培苗中没有检测到遗传变异。 3.试管苗DNA甲基化的MSAP检测 ‘红颜’筛选出扩增条带清晰、多态性高和稳定性好的19对引物，‘章姬’筛选出21对引物，采用这些引物对组培苗和田间植株进行DNA甲基化检测。结果表明，‘红颜’在继代5、7、9、10、11、12 次后，19 对引物共检测出个 2,189 基因位点，总甲基化率分别为 11.3%、8.4%、8.0%、9.5%、10.5%和 9.3%；‘章姬’在继代 5、7、9、10、11、12 次后，21 对引物共检测出2,522个基因位点，总甲基化率分别为10.5%、7.5%、7.1%、8.3%、8.4%和8.3%，因此DNA甲基化随继代次数的增加，组培苗的甲基化敏感多态性整体呈现出下降趋势。而组培苗植株在移栽后1、2、3月检测中，组培苗DNA甲基化水平又逐渐升高，且两个品种的DNA甲基化变异程度大致相同。 4. 冷驯化时DNA甲基化的MSAP检测 以‘章姬’组培苗为材料，采用14对选择性引物在冷驯化(4℃)过程中共检测出2,499个基因位点，处理0 d、1 d、3 d、5 d、7 d和10 d，基因组MSAP比率分别为27.2%、20.7%、25.8%、22.7%、22.7%和22.4%，DNA总甲基化水平整体呈下降趋势，恢复5 d后MSAP比率上升为26.05%。在DNA甲基化模式变化方面，以去甲基化现象为主，同时伴有甲基化现象发生。回收、克隆并测序某些草莓基因组的甲基化修饰位点，分离得到 5 条存在甲基化修饰的基因组DNA 序列。BLAST比对分析表明，在这些序列中都存在明显的“CCGG”二核苷酸成簇富集现象，与MSAP结果一致。

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