贵州省禽流感N6亚型基因克隆分析与血清学调查

摘要

禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza Virus，AIV)感染多种动物的一种急性高度接触性传染病。NA是禽流感病毒粒子表面的重要抗原，在病毒复制过程中发挥重要作用。近年来，家禽H5N6亚型禽流感疫情不断爆发和人感染H5N6亚型禽流感病例的出现， H5N6亚型禽流感才开始被关注。目前，我国报道的有关N6亚型禽流感病毒有H3N6、H4N6、H5N6和H6N6等。本实验室前期从临床健康鸭中分离出H6N6亚型禽流感病毒，本研究拟在此基础上，开展H6N6亚型禽流感病毒贵州株NA基因的克隆和序列分析、原核表达与多克隆抗体制备以及贵州省N6亚型禽流感血清学调查，以期为贵州省N6亚型禽流感的防控提供基础数据。 1．禽流感N6亚型基因克隆及序列分析 根据GenBank(登录号为KJ484613)禽流感病毒N6基因序列设计特异性引物，对贵州地区分离的H6N6亚型禽流感病毒贵州株进行N6基因的克隆与测序分析，结果显示：4株H6N6亚型禽流感病毒贵州株N6基因的编码区大小均为1380 bp，可编码459个氨基酸，其中从第175-207位缺失33个核苷酸，即编码蛋白颈部存在11个氨基酸缺失(TNSTTTIINN)；贵州株 N6 基 因的 核 苷 酸 同 源 性为 96.0%~99.1%，其 中A/duck/Guizhou/01/2017(H6N6) 与 A/duck/Guizhou/02/2017(H6N6) 为 同 一 分 支 ， A/duck/Guizhou/03/2017(H6N6)和A/duck/Guizhou/04/2017(H6N6)为另一分支；N6亚型毒株与其他非N6亚型毒株明显位于两大分支。 2．禽流感N6亚型基因的原核表达与多克隆抗体制备 回收H6N6亚型禽流感病毒贵州株A/duck/Guizhou/02/2017的N6基因扩增产物，克隆到原核表达载体PET-32a(+)，转化E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，His-tag镍柱亲和层析纯化N6基因表达蛋白，免疫家兔制备多克隆抗体， Western-blot检测表达产物的反应原性，结果显示：N6基因表达蛋白主要以包涵体形式存在，蛋白分子量约为70 kDa；表达的重组蛋白能被His抗体和兔源NA抗体所识别。 3．贵州省N6亚型禽流感血清学调查 以原核表达的N6蛋白为包被抗原，采用ELISA对2016年至2017年收集的813份鸡血清样本进行N6蛋白抗体检测，结果显示：在813份鸡血清样本中有186份为阳性，阳性率为22.88%，其中：2016年N6蛋白抗体阳性率为9.76%(20/205)，2017年N6蛋白抗体阳性率为27.30%(166/608)，阳性率呈现上升趋势。 综上所述，本实验成功对H6N6亚型禽流感病毒贵州株N6基因进行了克隆测序分析、原核表达与多克隆抗体制备和N6亚型抗体检测分析，提示贵州省N6亚型禽流感感染有上升趋势，这对贵州省N6亚型禽流感的预防与控制奠定了科学的基础数据。

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摘 要

Gene Analysis and Serological Investigation of Av

英文缩略表

实验研究

3.3.1 AIV贵州株N6基因同源性分析

经同源性分析显示，4株H6N6亚型AIV贵州株N6基因间的同源性为96.0%~99.1%，与2007

3.3.2 AIV贵州株N6基因遗传进化分析

系统进化树分析显示，4株H6N6亚型AIV贵州株N6基因在遗传进化树上处于同一大分支(图3)，表明4

3.3.3 AIV贵州株N6基因编码蛋白变异分析结果

经对N6基因编码蛋白氨基酸序列比对分析发现，4株H6N6亚型AIV贵州株N6基因均可编码459个氨基

3.4原核表达质粒PCR鉴定及酶切鉴定结果

用2.1步骤中的引物N6-F、N6-R进行目的片段PCR扩增，经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，均扩出