安吉白茶白化分子机制研究

摘要

安吉白茶（Camellia sinensis.'Baiye1'.），是典型的白化茶树品种，以其白化叶制成的绿茶因氨基酸含量高，滋味特别鲜爽，深得人民喜爱，其白化叶中氨基酸含量较返绿叶升高，茶多酚含量降低的分子机制尚不明确，因此研究其白化的分子机制具有重要的意义。本研究以安吉白茶为材料，分析其叶绿体的发育和叶绿素的合成，并对其转录组测序和基因组重测序分析，为安吉白茶叶色突变机制研究提供一定的理论基础，并取得以下研究结果： 1.安吉白茶白化叶和返绿叶叶绿体超微结构的观察 将安吉白茶白化叶和返绿叶制成切片并进行其叶绿体超微结构的观察，白化叶叶绿体内部结构发育不良，基粒散乱甚至断裂，返绿叶的叶绿体发育良好，基粒片层垛叠紧密、清晰。 2.安吉白茶白化叶和返绿叶叶绿素及其前体物质含量的测定 测定了叶绿素及其前体物质（δ-氨基乙酰丙酸、胆色素原、尿卟啉原Ⅲ和粪卟啉原Ⅲ、原卟啉Ⅸ和原脱植基叶绿素a）、类胡萝卜素等，除了Mg-原卟啉Ⅸ（Mg-protoⅨ）的含量是白化叶的高于返绿叶，并且差异显著，δ-氨基乙酰丙酸（ALA）、胆色素原（PGB）、粪卟啉原Ⅲ（CoprogenⅢ），原脱植基叶绿素a（Pchlide a），叶绿素a（Chlorophyll a），叶绿素b（Chlorophyll b）和类胡萝卜素（Carotenoid）在返绿叶中的含量均高于白化叶. 3.转录组测序分析 用白化期的表达模式与返绿期差异很大，叶绿体基粒（光合膜）的重要结构——捕光复合体、放氧复合体（OEC)、电子传递链、细胞色素b6/f复合体、F型H+转运ATP酶等结构的合成基因在白化期的表达整体下调，如铁硫细胞色素B6-F复合体合成基因（PetC）和铁氧化还原蛋白合成基因（PetF），质体蓝素合成基因（PetE）等。叶绿素合成过程的关键酶的合成基因在白化期表达也呈现出整体下调的趋势，如尿卟啉原-III合成酶（UROS）、镁螯合酶（Chl）、原叶绿素酸酯还原酶（PORA）、叶绿素合成酶（CHLG）等。从基因表达水平来看，安吉白茶的白化同时受到叶绿体发育和叶绿素合成的影响。 通过转录组的分析，安吉白茶的白化同时影响到了光合作用和抗病性有关的调控，在白化期间，除光合作用的光反应阶段相关基因下调以外，暗反应阶段的的相关基因的表达也整体下调；而与抗病性相关的基因的表达却出现整体上调的趋势。 4.安吉白茶基因组重测序结果 安吉白茶基因组（舒茶早作为测序参考基因组）重测序结果发现，安吉白茶的RNRL1（核糖核酸还原酶大亚基基因，能够影响dNTP的形成，从而影响叶绿体DNA的复制）发生了SNP非同义突变，其翻译的蛋白在这几个变异的氨基酸残基与附近的氨基酸残基形成的氢键减少，预测其翻译的蛋白活性位点与舒茶早有差异，推测是因为RNRL1的突变使其活性降低后影响了叶片发育过程中叶绿素的合成，使安吉白茶出现白化。 5.安吉白茶白化返绿相关基因表达量的分析 通过对安吉白茶的白化期和返绿期的叶片的一些相关基因的表达的定量分析，我们发现RNRL1，在安吉白茶白化和返绿阶段的表达量是返绿叶>白化叶，在白化期RNRL1的表达量达到最低，在白化叶中的表达量是在返绿叶中的0.58倍，因此我们进一步推测安吉白茶白化现象可能和RNRL1有关。

目录

第一章 文献综述

1.植物白化机制研究进展

1.1 植物白化现象

1.2 植物白化影响因素

1.3 遗传物质对植物白化的影响

1.4 白化茶树研究进展

2.安吉白茶研究进展

3研究内容、技术路线和目的意义

3.1研究内容

3.2技术路线

3.3目的意义

第二章 材料和方法

1材料与试剂

1.1实验材料

1.2实验试剂及仪器

1.3主要溶液的配制

2实验方法

2.1 植物超微结构的观察

2.2 叶绿素前体物质含量测定

2.3 植物样本的保存

2.4植株DNA提取

2.5 植株总RNA的提取

2.6 cDNA的合成

2.7 Real time-PCR反应

2.8 转录组测序和重测序

2.9 转录组测序分析方法

第三章 结果与分析

1.安吉白茶白化叶和返绿叶的获得

2.安吉白茶白化叶和返绿叶叶绿体超微结构的观察

3.安吉白茶白化叶和返绿叶叶绿素及其前体物质含量的测定

4. 转录组测序分析

4.1 差异基因聚类分析

4.2差异基因GO富集分析

4.3 差异基因KEGG分析

5. Real time-PCR分析及验证

6.安吉白茶基因组重测序结果

6.1 SNP、indel检测及注释

6.2 CNV、SV检测及注释

6.3 安吉白茶中白化转绿相关基因变异信息分析

6.4 对RNRL1的Real time-PCR分析

第四章 讨论

1 讨论

1.1安吉白茶白化和返绿过程中叶绿体的发育

1.2安吉白茶白化和返绿过程中叶绿素的合成

1.3 安吉白茶重测序中突变基因的分析

第五章 结论与展望

1.结论

2.展望

参考文献

附录

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