火龙果色素相关MYB基因的克隆及表达分析

摘要

MYB转录因子是一个成员庞大的超家族，具有功能多样性，广泛参与植物体生长发育、次级代谢调控及逆境应答等途径。近年来，关于MYB转录因子参与植物色素合成机制日益成为研究焦点，红肉火龙果果实中含有丰富的色素，在抗氧化和抗癌方面具有重要的作用，但针对转录因子MYB参与调控火龙果色素合成途径的研究报道较少，因此挖掘火龙果色素合成的关键基因，为更一步深入探索火龙果色素合成调控的分子机制奠定基础。 在前期工作基础上，本文以火龙果不同发育时期的果实为材料，利用qRT-PCR技术，根据表达趋势筛选色素积累相关的MYB转录因子，并采用RACE法克隆色素积累相关的MYB转录因子基因（HuMYB1841）全长序列；为了进一步探索该基因的功能，构建了用于酵母单杂交表达的载体，对深入探究MYB参与火龙果色素代谢的关键基因，以及通过基因工程创制含有丰富色素的新种质均具有重要意义。主要研究结果如下： 1、采用稳定性评估软件geNorm和NormFind并结合qRT-PCR方法，从17种候选内参基因中筛选出火龙果果实不同发育期的内参基因为TBP2与YLS8。 2、通过qRT-PCR与转录组数据相结合的分析方式，从基因表达水平上阐述了4个MYB转录因子在火龙果果实不同发育时期时空性表达情况。MYB1841在红肉品种-紫红龙的果实发育过程中，其表达量呈现先上调再下调，并且在破色期（H2）表达量达到最高值，而在白肉品种-晶红龙果实中表达量极低或不表达，该结果与甜菜色素合成途径中的关键基因CYP450趋势相似；MYB1222与MYB1841表达趋势较一致，但表达丰度较低；MYB636和MYB1082在火龙果果实发育期中整体表达量不稳定，呈现波动趋势；因此，推测MYB1841基因可能与火龙果色素合成密切相关。 3、利用RACE技术，克隆出MYB1841全长序列并命名为HuMYB1841，全长911bp，ORF639bp，共编码212aa；生物信息学分析表明，蛋白序列中具有MYB家族结构域，且属于R2R3类转录因子，HuMYB1841在MYB家族保守区域上同源性较高。 4、采用PEG介导的电化学法，将构建的融合蛋白表达载体（pBWA(V)HS-HuMYB1841-GFP）与空载（pBWA(V)HS-GFP）转入到拟南芥原生质体中共培养，激光共聚焦显微镜下观察显示，HuMYB1841蛋白具有核定位信号，与生物信息学软件预测结果一致，此结果为进一步理解HuMYB1841基因功能提供了新信息。 5、用常规PCR法克隆了参与甜菜色素合成途径的关键基因CYP450的启动子序列，序列长度为1547bp，并用在线软件对启动子内主要调控元件进行预测，结果发现有多处MYB转录因子结合位点。 6、为进一步探究基因HuMYB1841的功能，构建了用于酵母单杂交实验的诱饵载体（pAbAi-CYP450）和猎物载体（pGADT7-HuMYB1841），此外成功构建了诱饵酵母菌株。

目录

缩写名词表

第一章 绪 论

1.1 植物色素

1.1.1β-胡萝卜色素

1.1.2 花青素

1.1.3 叶绿素

1.1.4 甜菜红色素

1.2 甜菜色素研究进展

1.2.1 甜菜色素的理化性质

1.2.2 甜菜色素的功能与应用

1.2.3 甜菜素的代谢累积机制

1.2.4 火龙果甜菜素研究现状

1.3 植物MYB转录因子研究进展

1.3.1 植物MYB转录因子的结构特点

1.3.2 植物MYB转录因子的进化

1.3.3 植物MYB转录因子的功能

1.4 本研究内容、目的及意义

第二章 火龙果果实发育期内参基因及MYBs差异基因筛选

2.1 材料

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 植物总RNA提取

2.2.2 第一链cDNA的合成

2.2.3 火龙果发育期内参基因筛选

2.2.4 差异基因筛选

2.3 结果与分析

2.3.1 总RNA提取及检测

2.3.2 内参基因筛选

2.3.3 差异基因荧光定量PCR

2.4 讨论

2.4.1 火龙果不同发育期内参基因稳定性评估

2.4.2 MYB转录因子对色素调控的分析

第三章 HuMYB1841基因的克隆及亚细胞定位

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验试剂及仪器设备

3.1.3 HuMYB1841全长克隆

3.1.4 HuMYB1841基因生物信息学分析

3.1.5 HuMYB1841基因亚细胞定位

3.2 结果与分析

3.2.1 总RNA检测

3.2.2 HuMYB1841全长克隆

3.2.3 HuMYB1841基因生物信息学分析

3.2.4 HuMYB1841亚细胞定位分析

3.3 讨论

3.3.1 基因HuMYB1841的克隆及时空表达分析

3.3.2 基因HuMYB1841的亚细胞定位分析

第四章 火龙果CYP450基因启动子的克隆及酵母单杂载体构建

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料及仪器设备

4.1.2 火龙果CYP450基因启动子的克隆及诱饵载体构建

4.1.3 酵母猎物载体构建

4.1.4 诱饵载体菌株构建

4.2 结果与分析

4.2.1 PCR目标片段的获得

4.2.2 CYP450基因启动子的全长序列克隆

4.2.3 酵母单杂交载体构建

4.2.4 诱饵载体菌株构建

4.3 讨论

第五章 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 后期工作展望

致谢

参考文献

附录

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