贵州鸡源H9N2亚型禽流感病毒对鸡、鸭和小鼠致病性研究

摘要

目的：低致病性禽流感在禽类之间普遍存在，其病毒已在多种哺乳动物上分离到。为研究低致病性禽流感在不同畜种间跨畜种传播感染情况，了解低致病性禽流感的致病机制，为禽流感的防治以及公共卫生安全提供参考和理论依据，故本实验用鸡、鸭和小鼠三种动物来研究低致病性禽流感跨畜种感染动物的情况，了解不同动物的致病特点及致病机理。 方法：实验选用52d黑羽乌骨鸡24只，52d樱桃谷鸭24只，6-8周昆明系小白鼠24只，随机分成四组，按0d、3d、6d、9d作分组标记，每组鸡、鸭和小鼠6只，感染前0d组为阴性对照，感染后3d、6d、9d为阳性对照。0d阴性对照注射0.2mLPBS，3d、6d和9d阳性对照注射107.0EID50/0.2mL H9N2AIV（鸡鸭翅下静脉，小鼠尾静脉）。按0d、3d、6d、9d采集脏器组织和血液样品作为后续实验的材料。具体实验如下：（1）用血凝实验来测三种动物的血凝效价，观察临床和解剖病理症状，测肺系数，用三类细胞分析仪检测三种动物的血液生理指标及用免疫球蛋白G（IgG）ELISA试剂盒检测其IgG抗体水平；(2)将肺脏、气管等组织制作成切片，通过苏木素-伊红（HE）染色，并观察其病理变化情况；（3）用实时荧光定量PCR检测三种动物肺组织中的病毒含量；（4）将肺脏、气管等组织制作成切片，通过甲苯胺蓝（TB）染色，观察三种动物感染以后的肥大细胞（MC）的情况；（5）用ELISA试剂盒检测三种动物血液中的肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素2（IL-2）、组胺的含量（HIS）；（6）用实时荧光定量PCR方法检测肺组织中钙调蛋白（CaM）mRNA的转录情况，并用ELISA试剂盒检测三种动物肺组织中CaM的含量。 结果：（1）感染后血凝效价均≥24，对照组均＜24；感染动物荧光RT-PCR检测均有扩增曲线，空白对照没有扩增曲线；（2）鸡的白细胞在9d时显著下降(P＜0.05)，鸭的在3d时极显著升高（P＜0.01），小鼠的白细胞在6d和9d时极显著升高（P＜0.01）；鸡的红细胞在9d时显著降低（P＜0.05），鸭在3d和6d时极显著升高（P＜0.01），9d时显著升高（P＜0.05），小鼠在3d时显著升高（P＜0.05），6d和9d时极显著升高（P＜0.01）；鸡血小板在6d时显著升高（P＜0.05），鸭在3d和6d时极显著升高（P＜0.01）；感染后，鸡、鸭和小鼠IgG水平显著升高；（3）感染病毒后，鸡出现精神浓郁，食欲减退，胸腺和肺脏肿大，胸腔有积液，肺泡腔有明显的红细胞，肺组织大量的中性粒细胞，气管腔内可见有红细胞及渗出物；鸭有胸腔积液，肺肿大，肺组织有出血和大量的中性粒细胞；小鼠出现精神沉郁，食欲减退，肺肿和脾肿大，肺组织有红细胞。从病理评分上看，鸡、鸭和小鼠感染后3d和6d时病理评分值极显著升高（P＜0.01），6d时病理评分值最高，9d时与6d比，鸭和小鼠的病理评分值显著下降（（P＜0.05），鸡在6d时病理评分值极显著高于鸭（P＜0.01），而显著高于小鼠（P＜0.05）；（4）感染后，鸡鸭在肺、气管、肠、法氏囊和胸腺组织中的MC数量极显著升高（P＜0.01），在脾组织中的MC数量显著升高（P＜0.05）；（5）感染后三种动物肺组织的含毒在3d时含毒量最高，含毒量鸡＞鸭＞小鼠；（6）感染后，鸡、鸭和小鼠外周血中的IL-2、TNF-α、HIS均显著升高（（P＜0.05））；（7）感染后，三种动物肺组织中的CaM转录水平显著升高（P＜0.05），但CaM蛋白的表达量极显著降低（P＜0.01）。 结论： 1.证实低致病性禽流感可跨种畜传播，鸡易感，鸭次之，小鼠最不易感； 2.低致病性禽流感可造成动物肺组织为主的病理损伤，鸡的病理损伤最严重，小鼠的最轻； 3.低致病性禽流感感染后可引起炎性反应，并可诱导炎性因子释放，导致病理损伤； 4.低致病性禽流感可上调CaM mRNA在肺组织中的转录水平，但抑制CaM蛋白在肺组织中的表达。

目录

英文缩略

文献综述

前言

试验研究

1 材料

1.1实验动物与病毒

1.2实验试剂及材料

1.3主要仪器

2 方法

2.1实验动物分组与攻毒

2.2攻毒检测

2.3血液指标的测定

2.4 IgG的测定

2.5病理观察

2.6病毒检测

2.7 MC的观察

2.8 IL-2、TNF-α和HIS的检测

2.9 CaM的测定

2.10数据统计

3结果

3.1HA攻毒检测结果

3.2血液生理指标结果

3.3 IgG结果

3.4病理变化

3.5病毒含量检测

3.6 MC的观察

3.7 IL-2、TNF-α和HIS的结果

3.8 CaM的结果

4 讨论

4.1 低致病H9N2亚型禽流感可感跨种属感染动物

4.2 低致病流感对血液指标的影响

4.3 低致病性禽流感引起鸡、鸭和小鼠IgG显著升高

4.4低致病性禽流感鸡、鸭和小鼠明显的病理损伤

4.5 低致病性禽流感病毒在鸡肺中的含毒量最高

4.6低致病性禽流感引起鸡、鸭MC数明显升高

4.7低致病性禽流感引起鸡、鸭和小鼠的IL-2、TNF-α和HIS显著升高

4.8低致病性禽流感显著上调CaM mRNA的转录，但抑制CaM蛋白的表达

5结论

参考文献

附录

附图

致谢

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