种公猪精液传播的主要病毒性疫病监测及mPCR方法的建立

摘要

随着集约化规模化养猪业的快速发展，许多国家越来越广泛运用猪的人工授精技术（AI）进行配种繁殖。种公猪在养猪业生产中的地位十分重要，关系到母猪的受孕、妊娠与分娩以及仔猪的健康，而精液是否携带病毒则关系到猪场相关疫病的传播与否；虽然用于人工授精的精液里出现的病毒不一定导致母猪感染疫病，但精液仍然是传播病毒性疫病的一大风险。国内外许多研究表明种公猪精液是导致病毒性疫病传播的媒介，这些病毒既有DNA病毒又有RNA病毒，其中猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪日本乙脑炎病毒（JEV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）和猪细小病毒（PPV）是种公猪精液中最为常见的导致母猪繁殖障碍性的病原，种公猪精液如果携带这些病毒会导致猪繁殖障碍类等疫病的发生，引起妊娠母猪流产、产死胎或木乃伊胎或新生仔猪带毒，给养猪业健康生产造成了巨大的损失。由于这些猪病毒通常会引起非常相似的临床症状，且常伴随着混合感染，对混合感染的病原体进行单独检测往往比较费时，为实现在种猪精液多病原混合感染的快速诊断，本研究建立了针对CSFV、PRRSV、FMDV、JEV、PRV、PCV-2和PPV这七种病原体的七重PCR鉴别诊断方法，为种猪精液传播常见疫病的快速诊断和防控提供了理论和技术支撑。主要研究方法和研究内容如下： 1、种公猪精液传播的CSFV、PRRSV、JEV、FMDV、PRV、PCV-2和PPV单一PCR/RT-PCR方法的建立及检测 参照GenBank中CSFV E2（NC_002657）、PRRSV ORF7（NC_001961）、JEV E（AF315119）、FMDV VP1（KU204893.1）、PRV gB（GQ325658）、PCV-2ORF2（NC_005148）和PPV VP2（NC_001718）等保守基因序列，应用相应软件设计了7对PCR引物，分别用于扩增CSFV E2、PRRSVORF7、JEVE、FMDVVP1、PRVgB、PCV-2ORF2和PPV VP2等基因的部分序列，扩增的目的片段大小分别为516bp、224bp、721bp、331bp、187bp、282bp和947bp。通过对目的基因的测序鉴定以及反应的条件优化，建立了CSFV、PRRSV、FMDV、JEV、PRV、PCV-2和PPV的单一PCR/RT-PCR方法，为摸索建立种公猪精液多重PCR方法的条件打下基础。 单一PCR/RT-PCR诊断方法的建立结果表明：单一PCR最佳反应体系：CSFV、FMDV、PRV、PCV-2和PPV上下游引物各1.0μL，JEV、PRRSV上下游引物各1.5μL；各种病毒的模板都为1μL；反应体系为25μL最佳。单一PCR最佳反应条件：CSFV、PRRSV、PRV、和PPV最佳退火温度为54.5℃；JEV、FMDV、PCV-2最佳退火温度为56.5℃。敏感性和特异性实验表明：单一PCR对7种病毒的最低核酸检测量都达到了pg级，分别为CSFV3.2pg、PRRSV8.5pg、JEV8.7pg、FMDV2.6pg、PRV0.15pg、PCV-29pg和PPV5.4pg，建立的种公猪精液单一PCR检测方法对PEDV、SIV和E.coli的检测结果均呈阴性，表明成功建立种公猪精液传播的主要病毒性疫病单一PCR/RT-PCR快速诊断方法，该研究为临床种公猪精液传播的主要病毒性疫病流行病学调查奠定了基础。 应用建立的单一PCR对713精液样本进行CSFV、PRRSV、JEV、FMDV、PRV、PCV-2和PPV等7种常见病毒PCR检测，在713份样品中PCV2的阳性检出率（含单一与混合感染）是最高的，为7.57%（54/713）；其次为PRRSV，阳性检出率为6.73%（48/713），CSFV、JEV、PRV和PPV的阳性检出率分别为2.95%（21/713）、1.26%（9/713）、4.77%（34/713）和2.81%（20/713）；713份精液样本的单一PCR检测结果显示：未检测到FMDV的感染情况，出现了多种病毒之间混合感染的情况。 2、种公猪精液传播七种常见病毒多重PCR方法的建立与初步应用研究 在建立的CSFV、PRRSV、JEV、FMDV、PRV、PCV-2和PPV目的基因单一PCR/RT-PCR方法扩增结果的基础上，通过对多重PCR反应条件的优化，成功建立了能同时检测CSFV、PRRSV、FMDV、JEV、PRV、PCV-2和PPV七种病毒的多重PCR方法。结果表明：七重PCR最佳反应体系在50μL反应体系条件下最佳，其中7对引物上下游引物浓度JEV各0.5μL，CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2和FMDV各1.0μL，PPV各1.5μL；退火温度为54.5℃时多重PCR扩增效果最佳，每个靶基因均能出现特异性条带，且无特异性扩增；七重PCR最佳反应条件：50℃40min；95℃5min；94℃30s，54.5℃30s，72℃45s，35cycles；72℃10min。敏感性试验表明：建立的多重PCR最低核酸检测量均达到pg级，各种病毒的最低检测量分别为CSFV33pg、PRRSV56pg、JEV59.1pg、FMDV13.9pg、PRV11.5pg、PCV-261pg和PPV18.7pg，特异性结果表明均只能检测出目的条带，对SIV、PEDV、E.coli和正常组织扩增结果均呈阴性。表明成功建立种公猪精液传播的主要病毒性疫病七重PCR快速诊断方法，该七重PCR可用于临床精液样品的快速诊断和流行病学调查。 3、种公猪精液传播的七种病毒性疫病多重PCR诊断方法的临床初步应用 应用建立的种公猪精液传播的七种病毒性疫病多重PCR诊断方法对713份种公猪精液样品检测的结果表明：种猪场、规模化猪场和人工授精站存在不同程度的混合感染现象；其中在713份公猪精液样品中未检测到FMDV阳性样品，其他病毒单一感染率为10.1%；来自9个种猪场的314份精液样品的混合感染率为7.0%（22/314），其中PCV-2+PRRSV、JEV+CSFV和PRV+PCV-2的二重感染阳性率达4.5%（14/314），PRV+CSFV+PCV-2的三重感染率为0.9%（3/314），PPV+PRV+PCV-2+PRRSV和PPV+PRV+CSFV+PRRSV的四重感染率为1.3%（4/314），PPV+PRV+PCV-2+PRRSV+CSFV的五重感染率为0.3%（1/314）；来自6个规模化猪场的241份精液样品的混合感染率为7.46%（18/241），其中PCV-2+PRRSV、PPV+PRV和CSFV+JEV二重感染阳性率达4.98%（12/241），PRV+PCV-2+CSFV三重感染率为1.24%（3/241），PPV+PRV+PCV-2+PRRSV的四重感染率为0.41%（5/241），PPV+PRV+PCV-2+PRRSV+CSFV五重感染率为0.83%（1/241）；来自6个人工授精站的158份精液样本的混合感染率为5.06%（8/158），其中PCV2+PRRSV、CSFV+PCV-2和PPV+PCV-2的二重感染阳性率达4.43%（7/158），三重感染率为0（0/158），PPV+PRV+PCV-2+PRRSV四重感染率为0.63%（1/158），五重感染率为0（0/158）。通过应用建立的七重PCR对精液样品进行检测，然后应用建立的单一PCR方法进行验证，结果与单一PCR方法检测结果符合。通过应用建立的七重PCR对精液样品进行检测，然后应用建立的单一PCR方法进行验证，结果与单一PCR方法检测结果符合。由此可见，本研究建立的七重PCR方法不仅实现了上述七种病毒的同时检测，也能够对CSFV、PRRSV、FMDV、JEV、PRV、PCV-2和PPV单个或混合感染的精液临床样本进行快速鉴别诊断。

目录

第一章 文献综述

1 种公猪传播病毒性疫病的研究进展

1.1 种公猪精液传播的常见病毒性疫病

1.2 种公猪精液传播的其他病毒

2 猪病毒性疫病单一PCR和多重PCR方法研究进展

2.1 单一PCR/RT-PCR方法

2.2 二重PCR/RT-PCR方法

2.3 三重PCR/RT-PCR方法

2.4 四重PCR/RT-PCR方法

2.5 五重PCR/RT-PCR方法

2.6 六重PCR/RT-PCR方法

3 研究目的及意义

第二章 种公猪精液传播的CSFV、PRRSV、JEV、FMDV、PRV、PCV-2和PPV单一PCR/RT-PCR方法的建立及检测

1 材料

1.1 病毒、病料

1.2 主要试剂

1.3 主要溶液的配制

1.4 主要实验仪器

1.5 引物设计与合成

2 方法

2.1 病料处理

2.2 核酸提取

2.3 病毒核酸的PCR/RT-PCR扩增

2.4 CSFV、PRRSV、JEV、FMDV、PRV、PCV-2和PPV目的基因的鉴定

2.5 单一PCR/RT-PCR诊断方法的建立

2.6 单一PCR/RT-PCR诊断方法对临床样本的检测

3 结果

3.1 CSFV、PRRSV、JEV、FMDV、PRV、PCV-2和PPV目的基因的鉴定

3.2 单一PCR/RT-PCR诊断方法的建立

3.3 单一PCR/RT-PCR诊断方法对临床样本的检测

4 讨论

5 结论

第三章 种公猪精液传播七种常见病毒多重PCR方法的建立与初步应用研究

1 材料

1.1 病毒、细胞及病毒基因质粒

1.2 病料

1.3 主要试剂

1.4 主要溶液的配制

1.5 主要实验仪器

2 方法

2.1 病毒核酸提取

2.2 引物设计与合成

2.3 七重PCR诊断方法的建立

2.4 七重PCR诊断方法对种公猪精液临床病料的检测

3 结果

3.1 种公猪精液携带七种病毒七重PCR诊断方法的建立

3.2 七重PCR诊断方法对种公猪精液临床病料的检测

4 鉴别种公猪精液常见病毒七重PCR试剂盒的组装

4.1 对照的制备

4.2 mPCR Mix的制备

4.3 试剂盒的成分及组装

4.4 试剂盒操作说明

5 讨论

6 结论

参考文献

致谢

附录一 攻读硕士学位期间参与发表的学术论文

附录二 本文用到的部分英文缩写及含义说明

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