六月青有效萃取物筛选与护肝作用及其作用机制的实验研究

摘要

众所周知，肝脏疾病尤其是病毒性肝炎，对人类健康危害极大。目前，虽然在病毒性肝炎预防和治疗研究方面取得了巨大成绩，但可用于临床治疗的抗肝炎病毒药物非常有限，它们的治疗效果也不理想。因此，研制新型抗HBV药仍是面临的主要课题。 六月青，是抗HBV复方——复方六月雪的主要组成药物之一。本课题组对复方六月雪做了大量体内、体外的实验研究，现已证实：在体内，复方六月雪对CCl<,4>、AP和D-GalN所致急性化学性肝损伤有明显的保护作用，能明显地降低ALT、AST活性，提高肝脏细胞色素P450及细胞色素b5的含量；对于感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的广西麻鸭，复方六月雪能降低其血清ALT、AST的活性和DHBsAg、DHBeAg、DHBV-DNA的含量。在体外，采用直接加药法和血清药理学法观察复方六月雪对HepG2.2.15细胞的作用，结果对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的合成复方六月雪表现出较强的抑制作用，且抑制作用有明显的量效和时效反应关系。也就是说，复方六月雪体内及体外均有显著的抗HBV作用。而关于六月青的研究文献中，除了本课题组对其植物鉴定学等研究文献外，目前尚未见到其他尤其是化学成分、药理作用方面的文献报道。基于对复方六月雪的实验研究结果，本文对六月青展开系统的实验研究：先对六月青化学成分进行定性实验，然后用固-液萃取法将其分成不同萃取物，之后通过体内的抗肝损伤作用、对免疫功能的影响、体外细胞毒性作用、对HBV的抑制等实验筛选具有活性作用的萃取物，并对有效萃取物保肝作用机制进行实验研究。 【目的】通过体内、体外实验筛选六月青萃取物中的有效部位，并对有效部位体外抗HBV作用、体内抗化学性急性肝损伤及作用机制进行探讨研究。 【方法】 1、六月青化学成分定性分析试验与萃取物分离：采用传统的化学成分定性分析方法进行分析，用极性由小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇、60％乙醇依次进行萃取分离，对60％乙醇萃取物进行化学成分定性检识、紫外扫描和HPLC定性分析。2、60％乙醇萃取物对HepG2.2.15细胞DNA的抑制作用：对其体外抗HBV作用进行研究，采用FQ-PCR法检测不同浓度60％乙醇萃取物作用后HepG2.2.15细胞内DNA的含量。3、60％乙醇萃取物对急性肝损伤大鼠的影响：采用CCl4、D-GaIN致大鼠急性肝损伤，以肝脏重量指数、血清ALT、AST、ALP、Alb、Glo、TP、T.Bil、G-GT、LDH及肝组织病理切片为指标，观察60％乙醇萃取物对急性肝损伤大鼠的保护作用。4、60％乙醇萃取物对急性肝损伤小鼠的影响：以CCl<,4>、AP、D-GaIN作为急性肝损伤诱导剂，引起小鼠急性肝损伤，观察肝脏重量指数，胸腺重量指数，脾脏重量指数，血清ALT、AST、ALP、Alb、T-AOC，肝组织中SOD、MDA、TP、NO、GSH、GSH-Px及肝组织病理的变化，探讨60％乙醇萃取物对急性肝损伤的保护作用及作用机制。5六月青各萃取物体内试验：以四氯化碳所致急性肝损伤和环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠为模型，观察六月青各萃取物对急性肝损伤小鼠的肝脏指数、血清ALT和AST活性的影响，对免疫功能低下小鼠胸腺和脾脏重量、血清溶菌酶和TNF-α的影响。6、六月青各萃取物体外对HepG2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg的抑制作用：采用WST-8法检测各萃取物的细胞毒性，测定细胞存活率，计算TC<,50>；ELISA法测定各萃取物直接作用细胞后培养上清中HBsAg、HBeAg的含量，计算各萃取物的抗原抑制百分率、半数抑制浓度(IC<,50>)及治疗指数(TI)。7、六月青水、醇总提取物抗急性肝损伤的实验：以四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤，检测血清ALT、AST活性。 【结果】 1、化学成分定性分析结显示：六月青中含有皂苷、强心苷类、内酯类、香豆素类、酚类、有机酸、氨基酸、多肽、蛋白质、糖和苷类、鞣质类成分。薄层(TLc)对比实验表明不含靛蓝和靛玉红，用不同极性溶剂将六月青醇总提物进行萃取分离，得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇、60％乙醇部位共五个萃取物。60％乙醇萃取物化学成分定性分析结果提示：60％乙醇萃取物在209nm处有强吸收，可能含有皂苷类、强心苷、香豆素类、内酯类、植物甾醇、三萜类化学成分。2、60％乙醇萃取物能明显抑制HepG2.2.15细胞内HBV-DNA的复制，降低HBV-DNA的拷贝数，升高循环数(CT值)。3、对于CCl<,4>、D-GalN所致急性肝损伤的大鼠，60％乙醇萃取物能减轻肝脏重量，降低血清ALT、AST、ALP、G-GT、LDH活性，提高Alb、G1o、TP含量，减少T.Bil含量。4、对于CCl4、AP、D-GalN所致急性肝损伤小鼠，60％乙醇萃取物能减轻肝脏重量，增加胸腺重量，降低血清ALT、AST、ALP活性，提高A1b含量和T-AOC活性，提高肝组织中SOD、GSH、GSH．Px活性，降低肝组织中MDA含量和NO的活性。5、在六月青各萃取物中，石油醚部位、氯仿部位的高剂量和低剂量组及60％乙醇部位高剂量组的肝指数均明显低于CCl<,4>模型组，石油醚部位、氯仿部位及60％乙醇部位的高剂量和低剂量组均能显著地降低ALT活性，氯仿部位、60％乙醇部位高剂量组能明显降低AST活性，其他部位对AST、ALT活性没有明显影响。对于免疫抑制小鼠，五个萃取物均能增加胸腺重量和提高血清溶菌酶含量，对脾脏重量均无显著性影响，其中乙酸乙酯部位、水饱和正丁醇部位、60％EtOH部位还能提高血清TNF-α含量。6、六月青各萃取物体外对IIepG2.2.15细胞的影响：①氯仿部位、乙酸乙酯部位、水饱和正丁醇部位均有一定的细胞毒性，石油醚部位、60％乙醇部位对细胞的抑制随浓度增加而增强，TC<,50>分别为1.036mg/ml、7.818mg/ml，②细胞培养上清中HBsAg、HBeAg检测结果显示：石油醚部位、60％乙醇部位对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg有较强的抑制作用(TI均大于2)，60％乙醇部位高效低毒。7、INQ水、醇总提取物的最大耐受量(MTD)分别为153.0g生药/kg体重、369.0g生药/kg体重，分别相当于临床用药量的46、110.8倍。对于四氯化碳导致的ALT、AST活性升高，六月青水总提取物高、中剂量和醇总提取物高剂量能显著降低ALT、AST的活性(P<0.01)，六月青水总提取物低剂量能显著降低ALT活性，但不能显著降低AST活性，醇总提物中、低剂量对ALT、AST活性的降低作用不显著。 【结论】 1、六月青含有皂苷、内酯类、香豆素类、内酯类、酚类等多种化学成分，其水、醇总提取物对急性肝损伤有保护作用。2、用固．液萃取法将其分成石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇、60％乙醇部位共五个萃取物，其中60％乙醇部位在209nm处有强吸收，可能含有皂苷类、香豆素类、内酯类、植物甾醇、三萜类化学成分。药效学研究表明，在体外有显著的抗HBV作用，能显著抑制HBV-DNA的复制和HepG2.2.15HBsAg和HBeAg的表达；在体内有增强免疫功能作用，提高血清溶菌酶和TNF-α含量；对急性化学性肝损伤保护作用显著，降低血清中ALT、AST、ALP活性，提高血清Alb含量和T-AOC活性；可提高肝组织中SOD、GSH、GSH-Px活性，降低肝组织中MDA含量和NO的活性，从而增强机体氧化防御体系的功能，其作用机制可能与抑制脂质过氧化反应有关。3、此外，石油醚部位有一定的增强免疫功能和保护肝脏作用，能明显抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg。4、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇部位有增强免疫功能的作用，对HepG2.2.15细胞有一定的毒性，其中氯仿部位对急性化学性损伤的肝脏有保护作用。

目录

论文说明：主要英汉缩略对照表

声明

前言

第一部分六月青各萃取物的提取分离

1.实验材料

2.实验方法与结果

2.1化学成分定性分析

2.2薄层对比实验

2.5各萃取物的分离实验

2.460％乙醇部位化学成分定性分析

3.讨论

4.参考文献

第二部分六月青60％EtOH萃取物体内、外实验

一、六月青60％EtOH萃取物对HepG2.2.15细胞DNA的抑制作用

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.参考文献

二、六月青60％EtOH萃取物对CCl4、D-GalN致急性肝损伤大鼠的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.参考文献

三、六月青60％EtOH萃取物对CCl4、AP、D-GalN所致急性肝损伤小鼠的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.参考文献

小结

第三部分六月青各萃取物体内、外实验

一、六月青各萃取物对CCl4致急性肝损伤小鼠的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.参考文献

二、六月青各萃取物对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠的影响

1.实验材料与方法

2.实验结果

3.讨论

4.参考文献

三、六月青各萃取物体外对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.参考文献

小结

第四部分六月青水、醇总提取物对CCl4致急性肝损伤小鼠的影响

1.实验材料

2.实验方法

2.1急性毒性实验

2.2LYQ水、醇总提物对CCl4致急性肝损伤小鼠的保护作用

3.实验结果

3.1急性毒性实验

3.2LYQ水、醇总提物对CCl4致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响

4.讨论

5.参考文献

全文总结

综述：2.2.15细胞株筛选抗乙型肝炎病毒中草药实验研究进展

致谢

附图