端粒酶抑制剂作用人肝癌、鼻咽癌细胞株前后基因表达谱和蛋白表达谱变化的研究

摘要

目的：通过分析不同作用机制端粒酶抑制剂分别作用肝癌细胞株SMMC-7721、鼻咽癌细胞株CNE2后基因表达谱和蛋白表达谱的变化情况，挖掘不同端粒酶抑制剂影响的共性变化基因和共同差异蛋白，探讨影响端粒酶活性的可能分子靶点。 方法：1、MTT试验检测三种不同机制端粒酶抑制剂：EGCG，针对hTR的反义核苷酸序列ASODN和针对hTR的正义核苷酸序列SODN，分别抑制肝癌细胞株SMMC-7721、鼻咽癌细胞株CNE2的最佳作用浓度。2、培养两种癌细胞至对数生长期，以EGCG，ASODN和SODN的最佳作用浓度作用于细胞，提取药物作用后细胞的RNA，运用Affymetrix U133A 2.0人基因组表达谱芯片检测基因表达谱的变化，筛选共同差异基因。3、用EGCG，ASODN，SODN，ADM，ATRA，AZT，HAODN，HSODN八种不同的端粒酶抑制剂分别作用于SMMC-772l和CNE2细胞，提取药物作用后细胞的总蛋白，运用基层辅助激光解析时间飞行质谱(SELID-TOF-MS)技术检测蛋白的变化，筛选共同差异蛋白。 结果：1、MTT试验结果：以细胞抑制率达50％左右的药物浓度为最佳作用浓度，作用48h后，EGCG，ASODN及SODN对SMMC-772l细胞的最佳作用浓度分别为：125.0 mg/L，6.0 μ mol/L，6.0 μ mol/L；对CNE2细胞的最佳作用浓度同样为：125.0 mg/L，6.0 μ mol/L，6.0 μ mol/L。 2、EGCG，ASODN及SODN三种端粒酶抑制剂作用两种癌细胞后基因表达谱变化程度不一： (1)肝癌SMMC-7721细胞中，经EGCG作用后，表达差异2倍以上的基因共196个，包括上调基因132个和下调基因64个；ASODN作用后表达差异基因2025个，包括上调基因897个，下调基因1128个；经SODN作用后表达差异基因2337个，包括上调基因1254个，下调基因1083个。ASODN和SODN均改变了14500个基因中近14％基因的表达，EGCG影响表达的基因则不足2％。 (2)鼻咽癌CNE2细胞经EGCG作用后，表达差异2倍以上的基因3193个，包括上调基因1217个，下调基因1976个；ASODN作用后表达差异基因262个，包括上调基因158个和下调基因104个；SODN作用后表达差异基因151个，包括上调基因34个，下调基因117个。ASODN和SODN影响表达的基因均不足2％，EGCG影响表达的基因则达22％。 3、EGCG，ASODN及SODN三种端粒酶抑制剂作用两种癌细胞后的共同差异基因： (1)EGCG作用SMMC-7721细胞及CNE2细胞后均上调的10个基因：BTGI，TXNIP，SGK，LDLR，TRIBI，PER2，HISTIH2AG，HIFO，TFPI，HSPBAPI；均下调的8个基因：IDI，ID2，ID3，FABP3，AKRIBl0，PTGES，HSPHI，ANGPTL4。 (2)ASODN作用SMMC-7721细胞及CNE2细胞后均上调的11个基因：TIMP3，CYP51AI，NT5E，SPRY2，FGF2，AREG，SC4MOL，DDIT3，ETV4，RASA4，PHLDAI；均下调的9个基因：DCN，AKRIBIO，MRl，MUCl，UGTIAl0，AKRIC3，LXN，TMEM45A，UGTIA8。 (3)SODN作用SMMC-7721细胞及CNE2细胞后，均上调的2个基因：SERPINEI，KRTHA4；均下调的7个基因：KIAA0152，ANP32A，NPTXI，APISl，HMGCSI，HISTIH4C，SC4MOL。 (4)三种抑制剂作用SMMC-7721细胞后，均上调的12个基因：BTGI，WSBI，MXII，CCNG2，BCL6，WASL，SCAMPl，HIFO，RALGDS，FOS，TFPI，KLHL24：均下调的4个基因：D1O2，AKRIB10，ID3，AKRIC1。 (5)三种抑制剂作用CNE2细胞后，均上调仅1个基因KRTHA4，均下调仅1个基因CA5B。 (6)共同表达差异基因的功能涉及信号转导、细胞周期调控、转录调控、细胞凋亡、能量代谢等。 4、ADM，ATRA，AZT，ASODN，SODN，EGCG，HASODN和HNODN八种端粒酶抑制剂作用两种癌细胞后蛋白表达谱的变化： (1)SMMC-7721细胞经八种端粒酶抑制剂作用后，分别有28，20，33，12，24，18，10，23个蛋白质低表达；分别有6，20，7，41，13，25，42，20个蛋白质高表达。 (2)CNE2细胞经八种端粒酶抑制剂作用后，分别有14，26，27，23，31，42，26，30个蛋白低表达；分别有22，11，18，18，7，7，13，8个蛋白质高表达。 5、ADM，ATRA，AZT，ASODN，SODN，EGCG，HASODN和HNODN八种端粒酶抑制剂作用两种癌细胞后的共同差异蛋白： (1)于SMMC-7721细胞，八种端粒酶抑制剂作用组均呈低表达的差异蛋白6个，相对分子量分别为2477.89 Da，3723.96 Da，3898.37 Da，4067.51Da，4127.75 Da和4216.32 Da；均高表达的差异蛋白2个，相对分子量分别为2205.47Da和6647.26 Da。 (2)于CNE2细胞，八个端粒酶抑制剂作用后均呈低表达的差异蛋白1个，相对分子量为2657.14 Da；无共同高表达的差异蛋白。 结论： 1、在同种肿瘤细胞中，三种端粒酶抑制剂EGCG、ASODN及SODN作用后，表现出共性变化的基因。ADM，ATRA，AZT，ASODN，SODN，EGCG，HASODN和HNODN八种端粒酶抑制剂作用后，亦表现出共性变化的蛋白。这些基因与蛋白可能参与了端粒酶活性的调控，并可能为调控端粒酶活性的关键点和不同机制端粒酶抑制剂作用的共同靶点。 2、在不同肿瘤细胞(SMMC-7721细胞和CNE2细胞)之间，没有发现三种端粒酶抑制剂作用后均共性变化的基因；也无八种端粒酶抑制剂作用后均共性变化的蛋白。提示端粒酶抑制剂对不同种类肿瘤细胞的作用机理和作用位点可能不同。

目录

论文说明：主要缩略语

声明

前言

第一部分：端粒酶抑制剂作用人肝癌细胞株SMMC-7721、人鼻咽癌细胞株CNE2后基因表达谱变化的研究

第二部分：端粒酶抑制剂作用人肝癌细胞株SMMC-7721、人鼻咽癌细胞株CNE2后蛋白表达谱变化的研究

结语

参考文献

综述：基因芯片在肝细胞肝癌中的应用进展

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢