基于调节SDF-lα/CXCR4轴的脑脉通对脑缺血/再灌注老龄大鼠脑微血管生成机制研究

摘要

背景：
　　缺血性脑血管疾病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)作为临床危、急、重病之一，发病既有其慢性复杂的病理基础，又有其凶险多变的急性演变过程，且其发病率和死亡率均随年龄增加而增高，严重危害老年人的身心健康。在我国，随着老年人口的增多及老龄化社会的到来，深入研究老年缺血性脑卒中的发病机制，寻求有效的治疗方案已显得十分迫切。近年来，治疗性血管生成概念的引入，为 ICVD的治疗提供了新的思路。血管生成不仅是一个复杂的组织学和生物学过程，同时也是一个在动态平衡中的复杂信号转导调控变化的过程，而对此调控机制的深入研究既是全面认知血管生成复杂过程的重要途径，又可使我们进一步明确 ICVD的病理生理特点，并为治疗缺血性脑血管疾病开辟新的途径。随着对信号转导通路在脑缺血/再灌注(I/R)血管生成中机制的研究，逐渐认识到信号转导通路调节的血管生成在重构新的血管网方面的作用，但有关I/R后血管生成尤其是老年血管生成方面的研究鲜见报道。本课题在前期研究的基础上，从通过评估神经功能障碍评分的改变，观察脑梗死面积及缺血脑组织病理损伤变化，运用免疫组化法研究α-SMA、SDF-lα、CXCR4蛋白阳性的表达变化来探讨老龄大鼠脑 I/R脑微血管生成机制，并以此为切入点进一步阐释中药复方脑脉通对脑微血管生成的促进作用及其可能的作用机制。
　　目的：
　　1、通过比较青年组、老龄组、尼莫地平模型组和脑脉通模型组大鼠脑I/R后神经功能障碍评分、脑组织缺血面积及缺血后脑组织病理的变化，来探讨老龄大鼠脑I/R后脑组织损伤特点及脑脉通对老龄大鼠I/R后脑组织的保护作用。
　　2、通过观察青年组、老龄组、尼莫地平模型组和脑脉通模型组大鼠I/R后脑组织α-SMA蛋白的表达，来探讨老龄大鼠脑I/R后脑组织α-SMA蛋白的表达规律及脑脉通对老龄大鼠I/R后脑组织微血管生成的促进作用。
　　3、通过观察青年组、老龄组、尼莫地平模型组和脑脉通模型组大鼠I/R后脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白的表达，来探讨老龄大鼠脑I/R后脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白的表达规律及脑脉通对SDF-lα、CXCR4蛋白表达的调节作用。
　　方法：
　　1、采用神经功能综合评分法、TTC染色法及光镜技术观察分别比较各组大鼠脑缺血态(I)3h再灌注(I/R)24h、3d、6d、12d时神经功能障碍评分、脑组织缺血面积及缺血区脑组织病理损伤的改变。
　　2、采用免疫组织化学方法观察各组大鼠脑缺血(I)3h再灌注(I/R)24h、3d、6d、12d时脑组织α-SMA蛋白阳性表达变化。
　　3、采用免疫组织化学方法观察各组大鼠脑缺血(I)3h再灌注(I/R)24h、3d、6d、12d时脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白阳性表达变化。
　　结果：
　　1、老龄大鼠脑I/R后神经功能障碍、脑组织梗死面积和脑组织病理改变及脑脉通对其改变的影响
　　1.1、神经功能障碍与青年假手术组及老龄假手术组比较，各相应模型组时间点神经功能障碍综合评分均减低（P<0.01，P<0.05），且其神经功能障碍综合评分随时间的延长呈现减低趋势，并在脑 I/R6d时神经功能障碍评分最低（P<0.01），相对于I/R6d时，其神经功能障碍在I/R12d呈减轻改变（P<0.05）；与青年模型组各相同时间点比较，老龄模型组I/R6d、I/R12d神经功能障碍评分均减少（P<0.01，P<0.05）；与老龄模型组各相同时间点比较，脑脉通组、尼莫地平组各时间点神经功能障碍评分均增加（P<0.01，P<0.05）；与尼莫地平组相同时间点比较，脑脉通组I/R3d、I/R6d、I/R12d神经功能障碍评分均增加（P<0.01，P<0.05）。
　　1.2、脑组织梗死面积与青年假手术组及老龄假手术组比较，各相应模型组时间点脑组织梗死面积均增大，且其梗死面积随时间的延长呈现增大趋势，并在脑I/R6d时其梗死面积最大（P<0.01），相对于 I/R6d时，其梗死面积在I/R12d呈减小改变；与青年模型组各相同时间点比较，老龄模型组 I/R6d、I/R12d时间点脑组织梗死面积增大（P<0.01，P<0.05）；与老龄模型组各相同时间点比较，脑脉通组、尼莫地平组各时间点脑组织梗死面积均减小（P<0.01，P<0.05）；与尼莫地平组各相同时间点比较，脑脉通组I/R6d、I/R12d脑组织梗死面积均减小（P<0.01，P<0.05），尤以12d为著（P<0.01）。
　　1.3、脑组织病理改变通过常规HE染色，光镜下观察各模型组大脑皮质缺血中心区与半暗带区脑组织损伤的病理变化发现，在I3h开始出现组织水肿；I/R24h、I/R3d天时水肿程度逐渐加重，神经纤维紊乱，血管间隙增宽；I/R6d时水肿达到高峰，同时可见大量神经细胞、胶质细胞变性坏死，微血管结果破坏；I/R12d时水肿基本消失，神经元、胶质细胞、神经纤维减少，坏死液化灶出现。与青年模型组相同时间点比较，老龄各模型组水肿出现早，组损伤较严重，恢复速度较慢；与老龄模型组相同时间点相比，药物干预各模型组病理组织损伤较轻，药物可以明显减轻老龄大鼠脑I/R病理损伤，尤以脑脉通组脑保护作用为著。
　　2、老龄大鼠脑I/R后脑组织α-SMA蛋白表达变化及脑脉通对其表达的影响
　　免疫组化检测结果发现：青年假手术组和老龄假手术组脑组织内均可见α-SMA蛋白弱阳性表达；与青年假手术组和老龄假手术组比较，各相应模型组时间点脑组织α-SMA蛋白表达均增加，且其表达随时间的延长呈现增加趋势，并在脑I/R12d时表达最高（P<0.01）；与青年模型组相同时间点比较，老龄模型组各时间点脑组织α-SMA蛋白表达均减少（P<0.01，P<0.05）；与老龄模型组相同时间点比较，脑脉通组、尼莫地平组各时间点脑组织α-SMA蛋白表达均增加（P<0.01，P<0.05）；与尼莫地平组相同时间点比较，脑脉通组各时间点脑组织α-SMA蛋白表达均增加（P<0.01，P<0.05）。
　　3、老龄大鼠脑I/R后SDF-lα、CXCR4蛋白表达变化及脑脉通对其表达的影响
　　免疫组化检测结果发现：青年假手术组和老龄假手术组脑组织内均可见SDF-lα、CXCR4蛋白弱阳性表达；与各相应假手术组比较，各模型组各时间点脑组织 SDF-lα、CXCR4蛋白表达均增加，且其表达随时间的延长呈现增加趋势，并在脑 I/R6d时表达最高（P<0.01），相对于 I/R6d时，其表达在 I/R12d呈减少改变；与青年模型组各相同时间点比较，老龄模型组各时间点脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白表达均减少（P<0.01，P<0.05）；与老龄模型组各相同时间点比较，脑脉通组、尼莫地平组各时间点脑组织 SDF-lα、CXCR4蛋白表达均增加（P<0.01，P<0.05）；与尼莫地平组各相同时间点比较，脑脉通组各时间点脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白表达均增加（P<0.01，P<0.05）。
　　结论：
　　1、随着增龄，在相同损伤条件下，老龄大鼠脑 I/R后脑组织损伤出现早、程度重、恢复慢；随着脑 I/R时间的延长，各模型组脑组织损伤均有不同程度的修复，与其他模型组相比，脑脉通可明显改善老龄大鼠脑 I/R后组织的损伤。
　　2、大鼠脑 I/R后，各模型组脑组织内可见α-SMA蛋白表达，且随着 I/R时间的延长，各模型组脑组织内α-SMA蛋白阳性率表达逐渐升高，尤以脑脉通组表达相对较高，提示脑脉通促进了老龄大鼠脑 I/R后脑组织微血管的生成。
　　3、大鼠脑 I/R后，各模型组脑组织内可见 SDF-lα、CXCR4蛋白表达，尤以脑脉通组表达相对较高；脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注后微血管生成的作用机制，可能与提高缺血半暗带区信号效应分子SDF-lα、CXCR4蛋白表达，激活SDF-lα/CXCR4信号转导轴，募集大量血管生成因子到缺血脑组织，从而促进血管生成有关。

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前言

第一章 老龄大鼠脑I/R后脑微血管生成机制

实验一 老龄大鼠脑I/R后神经功能障碍、脑组织梗死面积及脑组织病理损伤的变化

实验二 老龄大鼠脑缺血/再灌注后脑组织α-SMA蛋白表达的变化

实验三 老龄大鼠脑缺血/再灌注后脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白表达的变化

第二章 脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注后脑微血管生成的作用

实验一 脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经功能障碍、脑组织梗死面积及脑组织病理的影响

实验二 脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注后脑组织α-SMA 蛋白表达的影响

实验三 脑脉通对老年大鼠脑缺血/再灌注后脑组SDF-lα、CXCR4 蛋白表达的影响

讨论

1 实验动物模型的讨论

2. 促进微血管生成及恢复脑缺血区的血液再灌注对老年缺血性脑血管病的意义

3.中药复方脑脉通对脑 I/R老龄大鼠脑微血管生成的意义

4免疫组织化学方法检测脑I/R大鼠各项指标的评价

5.老龄大鼠脑I/R后脑微血管生成机制及脑脉通对其的影响

6 存在的问题

结论

致谢

参考文献

附录

附录一 照片

附录2 文献综述

附录3 在校期间论文发表情况