超声微泡靶向介导microRNA-21调控PDCD4/NF-κB/TNF-α通路防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤机制的研究

摘要

冠状动脉微栓塞（Coronary Microembolization，CME）是急性冠脉综合征（Acute Coronary Syndrome，ACS）和经皮冠状动脉介入(PercutaneousCoronary Intervention，PCI)治疗过程中由于粥样硬化斑块碎屑的脱落引起的远端微血管栓塞的棘手并发症，是患者远期预后不良和主要心脏不良事件发生的强烈预测因子。目前研究表明CME致心功能损伤的机制主要与心肌局部炎症有关，尤其与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)密切相关，但其具体的调控机制尚不完全清楚。
　　程序性细胞死亡因子4(programmed cell death4，PDCD4)是近年来新发现的抑癌基因，不仅对细胞的程序性死亡进行重要调节，而且对于炎症发生也有重要作用，Sheedy等报道PDCD4可以促进核因子-κB(nuclearfacotr-κappa B，NF-κB)活化，同时抑制IL-10的上调，促进炎症的发生。我们前期研究发现，不稳定性心绞痛患者PCI术后PDCD4表达明显增加，促使TNF-α分泌增多，介导了PCI术后心肌的炎症反应。由于CME是PCI治疗过程中常见的并发症，在预实验中我们也发现CME后猪心肌细胞PDCD4表达水平明显升高。因此，PDCD4介导的信号通路很有可能参与了CME后心肌炎症反应的发生，进而导致心肌损伤。
　　MicroRNA(miRNA)是一类长约21～25个核苷酸的小分子RNA，广泛存在于动物、植物、病毒和单个细胞生物体中。miRNA存在于基因组的非编码区，是一类重要的转录后调节基因，具有调节细胞增生、分化、凋亡、炎症等过程的功能。
　　超声靶向微泡破裂(ultrasound-targetedmicrobubble destruction，UTMD)是近年来新起的一种高效、安全、具有靶向性的非病毒基因传输技术，可以使目的基因更容易进入组织细胞内，实现并增强基因的转染及表达效率。因此，本研究拟经导管建立CME猪的动物模型，构建microRNA-21真核表达质粒，通过超声微泡靶向介导转染microRNA-21，检测CME后PDCD4/NF-κB/TNF-α信号转导通路的激活情况，以深入阐明microRNA-21防治CME致心肌损伤的效应机制。
　　第一部分 冠状动脉微栓塞致心肌损伤过程中PDCD4的表达及动态变化
　　目的:本实验目的是通过建立猪的冠状动脉微栓塞(coronarymicroembolization，CME)模型，观察CME致心功能损伤与程序性细胞死亡因子4（programmed cell death4，PDCD4）表达的动态变化及关系。
　　方法:60头巴马小猪分为微栓塞组（CME组）、假手术组（Sham组），每组小猪均为30只;经微导管左前降支注入微栓塞球构建CME模型组，注射生理盐水构建假手术组。每组小猪按不同观察时间点随机分为0h、3h、6h、9h、12h、24h组（每组小猪均为5头）。应用心脏超声检测心功能指标;电化学发光法(ECL)检测血清肌钙蛋白(cTnⅠ)水平;组织病理切片苏木素-伊红（HE）染色和苏木素碱性复红苦味酸(HBFP)染色进行梗死区域测量;荧光定量PCR检测心肌组织PDCD4与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达;Western blotting检测心肌组织PDCD4与TNF-α蛋白表达。
　　结果:超声心动图参数显示，CME组除0h时间点外其余时间点左室射血分数（LVEF）均较Sham组明显降低(P＜0.05)，伴随着LVEF显著下降，心脏超声表现为左室短轴缩短率(FS)和心排血量(CO)下降及左室舒张期末径(LVEDd)增加。血清心肌损伤标志物cTnⅠ在CME后3h开始升高，9h达到高峰，24h开始下降，但仍高于基础值(P＜0.05)。病理学显示，CME组3h、6h、9h、12h、24h时间点均可见微梗死灶，但各时间点之间的微梗死面积比较无统计学差异(P＞0.05)。荧光定量PCR结果显示，CME组心肌组织PDCD4与TNF-α mRNA表达都是在3h开始升高，9h达高峰，12h和24h下降(P＜0.05)，
　　结论:PDCD4参与了CME致心功能的损伤，并呈现出明显的时间变化规律，可能是通过调控心肌TNF-α的表达实现。
　　第二部分 PDCD4/NF-κB/TNF-α信号转导通路在猪冠状动脉微栓塞致心肌损伤中作用机制的研究
　　目的:冠状动脉微栓塞(coronary microembolization，CME)是冠状动脉血栓性病变行经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)过程中常见的并发症，CME所致的心肌局部炎症反应是引起进行性心功能障碍的主要原因，程序性细胞死亡因子4(programmed cell death4，PDCD4)/核因子-κB（nuclear facotr-κappa B，NF-κB）信号通路在炎症的发生发展中起着重要的作用，但其在CME中的作用尚不清楚，因此本研究探讨PDCD4/NF-κB/TNF-α信号通路对小猪CME致心肌炎症反应及心肌损伤的影响。
　　方法:20头巴马小猪随机分为假手术组（Sham组）、微栓塞组(CME组)、CME+siRNA-PDCD4组、CME+siRNA-Control组，每组小猪均为5只。经微导管左前降支注入微栓塞球构建CME模型组，注射等量生理盐水构建Sham组。CME+siRNA-PDCD4组于CME前72h经微导管在左前降支注入PDCD4 siRNA转染复合物。CME+siRNA-Control组于CME前72h经微导管在左前降支注入等量Control siRNA混合液。应用心脏超声检测心功能指标;电化学发光法(ECL)检测血清肌钙蛋白(cTnⅠ)水平;组织病理切片HE及HBFP染色进行梗死区域测量;荧光定量PCR检测心肌组织PDCD4与肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达;Western blotting检测心肌组织PDCD4与TNF-α蛋白表达;应用凝胶电泳迁移率转变分析(EMSA)评价NF-κB活性。
　　结果:(1)超声心动图参数显示，与Sham组比较，CME组心功能显著降低，表现为心肌收缩功能障碍和左室扩张即左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS)、心排血量(CO)下降(P＜0.05)以及左室舒张期末径(LVEDd)增加(P＜0.05);与CME组比较，CME+siRNA-PDCD4组可改善CME导致的心功能损伤，下降血清cTnⅠ水平，表现为LVEF、FS、CO升高(P＜0.05)以及LVEDd减小(P＜0.05)。(2)与Sham组比较，CME组PDCD4与TNF-α的mRNA和蛋白表达量以及NF-κB活性均显著增加(均P＜0.05);与CME组比较，CME+siRNA-PDCD4组中PDCD4与TNF-α的mRNA和蛋白表达量以及NF-κB活性明显较低（均P＜0.05）。
　　结论:PDCD4/NF-κB/TNF-α信号转导通路激活是CME致心肌损伤的重要机制，提示抑制PDCD4/NF-κB/TNF-α信号转导通路可能成为CME防治的潜在新靶点。
　　第三部分 超声微泡靶向转染microRNA-21调控PDCD4/NF-κB/TNF-α通路防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤
　　目的:冠状动脉微栓塞(coronary microembolization，CME)后导致的炎症反应是引起心肌损伤的主要原因，PDCD4/NF-κB/TNF-α信号转导通路在CME致心肌炎症反应中起到重要的作用，microRNA-21对心肌有保护作用，主要是通过调控其靶基因PDCD4实现，因此本研究探讨超声微泡靶向转染microRNA-21对CME小猪心功能的影响及其可能机制。
　　方法:20头巴马小猪随机分为假手术组（Sham组）、微栓塞组(CME组)、CME+超声介导基因组、CME+单纯基因组，每组小猪均为5只。经微导管左前降支注入微栓塞球构建CME模型组，注射等量生理盐水构建Sham组。CME+超声介导基因组于CME前4d经耳缘静脉注入质粒-微泡混合液，同时予超声基因转染治疗仪经猪胸壁辐照心肌。CME+单纯基因组于CME前4d经耳缘静脉注入质粒-微泡混合液，不予超声辐照。应用心脏超声检测心功能指标;电化学发光法(ECL)检测血清肌钙蛋白(cTnⅠ)水平;组织病理切片HE及HBFP染色进行梗死区域测量;冰冻切片荧光显微镜评估绿色荧光蛋白(GFP)标记基因表达量;荧光定量PCR检测心肌组织PDCD4与肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达;Western blotting检测心肌组织PDCD4与TNF-α蛋白表达;应用凝胶电泳迁移率转变分析(EMSA)评价NF-κB活性。
　　结果:(1)与单纯基因组相比，超声介导基因组可使心肌内外源基因表达水平提高8倍以上(P＜0.05)。(2)超声心动图参数显示，与Sham组比较，CME组心功能显著降低，表现为心肌收缩功能障碍和左室扩张即左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS)、心排血量(CO)下降(P＜0.05)以及左室舒张期末径(LVEDd)增加(P＜0.05)。
　　结论:超声微泡靶向转染microRNA-21可以有效的改善CME致心肌损伤，其主要机制是通过抑制PDCD4/NF-κB/TNF-α信号转导通路，减少心肌炎症反应起效。

目录

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个人简历

摘要

前言

参考文献

第一部分 冠状动脉微栓塞致心肌损伤过程中PDCD4表达及动态变化

引言

一．材料与方法

二．实验结果

三．讨论

四．小结

参考文献

第二部分 PDCD4/NF-κB/TNF-α信号转导通路在猪冠状动脉微栓塞致心肌损伤中作用机制的研究

引言

一．材料与方法

二．实验结果

三．讨论

四．小结

参考文献

第三部分 超声微泡靶向转染microRNA-21调控PDCD4/NF-κB/TNF-α通路防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤

引言

一．材料与方法

二．实验结果

三．讨论

四．小结

参考文献

全文总结

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文献综述

致谢

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